一种反义寡核苷酸链及其沉默茶树黄嘌呤脱氢酶基因的方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种反义寡核苷酸链及其沉默茶树黄嘌呤脱氢酶基因的方法及应用，属于寡核苷酸的应用技术领域。茶树嘌呤生物碱代谢的研究中常利用别嘌醇来降低黄嘌呤脱氢酶的活性，但由于与嘌呤化合物的结构相似，别嘌醇及其代谢物会抑制嘌呤生物碱代谢途径中的其他酶，可能会影响应用的效果。本发明专利技术公开的反义寡核苷酸链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该反义寡核苷酸链可与茶树体内黄嘌呤脱氢酶基因(CsXDH1)特异结合，是一种沉默该基因表达及降低黄嘌呤脱氢酶活性的有效方式，可以用于干扰茶树嘌呤生物碱的代谢。茶树嘌呤生物碱的代谢。茶树嘌呤生物碱的代谢。

【技术实现步骤摘要】
ID NO.1所示，通过与茶树体内黄嘌呤脱氢酶基因(CsXDH1)特异性结合来达到沉默该基因的目的。相比于利用别嘌醇来沉默茶树体内黄嘌呤脱氢酶的活性(别嘌醇与嘌呤化合物的结构相似，别嘌醇及其代谢物会抑制嘌呤生物碱代谢的其他酶，可能会影响应用的效果)，本专利技术公开的反义寡核苷酸链能够专一地作用于黄嘌呤脱氢酶基因(CsXDH1)，从而降低黄嘌呤脱氢酶的活性。
[0011]本专利技术的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本专利技术的实践中得到教导。本专利技术的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
[0012]为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作优选的详细描述，其中：
[0013]图1为反义寡核苷酸链(CsXDH1
‑
asODN)沉默测试结果；
[0014]图2为反义寡核苷酸链(CsXDH1
‑
asODN)沉默对不同物质含量的影响，其中A为反义寡核苷酸链(CsXDH1
‑
asODN)沉默黄嘌呤脱氢酶基因(CsXDH1)后对黄嘌呤含量的影响、B为反义寡核苷酸链(CsXDH1
‑
asODN)沉默黄嘌呤脱氢酶基因(CsXDH1)后对咖啡碱含量的影响、C为反义寡核苷酸链(CsXDH1
‑
asODN)沉默黄嘌呤脱氢酶基因(CsXDH1)后对可可碱含量的影响。
具体实施方式
[0015]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本专利技术的精神下进行各种修饰或改变。需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本专利技术的基本构想，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0016]实施例1
[0017]一种反义寡核苷酸链沉默茶树黄嘌呤脱氢酶基因(CsXDH1)表达的应用，具体如下：
[0018]取一芽一叶的茶树嫩梢作为待处理的样品，分别置于实验组(条件为：将反义寡核苷酸链(CsXDH1
‑
asODN)溶于40μM的蔗糖溶液，使CsXDH1
‑
asODN浓度为30μM)和对照组(条件为：40μM的蔗糖溶液)的离心管中进行孵育3d，实验组和对照组分别设置10次重复。环境温度保持在23
±
1℃；湿度约为70％；使用可见全光谱LED光源，模拟一天中16小时的白天(光照强度为240μmol
·
m
‑2·
s
‑1)和8小时的夜晚。孵育结束后，将实验组的样品(用反义寡核苷酸链(CsXDH1
‑
asODN)和蔗糖处理后的样品)和对照组的样品(用蔗糖处理后的样品)用液氮快速冷冻，在
‑
80℃下保存，用于分子检测。
[0019]分子检测过程的条件如下：(1)使用Quick RNA Isolation Kit(华越洋，中国北京)提取处理样品的总RNA；(2)利用Goldenstar
TM RT6 cDNA Synthesis Kit(擎科，中国北
京)将每个样品的总RNA反转录为cDNA，用于实时荧光定量PCR(qRT
‑
PCR)基因表达实验；(3)将CsTIP41基因作为光处理的内参(其引物序列包括上游CsTIP41
‑
J
‑
F1(tggagttggaagtggacgagaccga)和下游CsTIP41
‑
J
‑
R1(ctctggaaagtgggatgtttgaagc))，其中黄嘌呤脱氢酶基因(CsXDH1)的检测引物序列包括上游CsXDH1
‑
J
‑
F1(cagcggctctggaatgaactgaag)和下游CsXDH1
‑
J
‑
R1(aaccttgccccatctcaacaccc)。上述序列均利用Primer premier 5.0软件设计，qRT
‑
PCR实验在CFX96
TM Real
‑
Time System(伯乐，美国加利福尼亚州)上进行，荧光试剂采用MonAmp
TM ChemoHS qPCR Mix(莫纳生物，中国江苏)。试剂比例：MonAmp
TM ChemoHS qPCR Mix 10μL；正向引物(10μM)0.4μL；反向引物(10μM)0.4μL；cDNA(50ng/μL)2μL；Nuclease
‑
Free Water 7.2μL；总反应体系为20μL，每个样重复三次。扩增反应程序为：95℃下10min；95℃下10s，60℃下30s，40个循环。采用2
‑
ΔΔCt
法计算基因的相对表达水平。
[0020]实施例2
[0021]一种反义寡核苷酸链沉默茶树黄嘌呤脱氢酶编码基因(CsXDH1)的表达后，影响黄嘌呤、咖啡碱和可可碱含量的应用，具体如下：
[0022]采用实施例1中得到的实验组的样品(用反义寡核苷酸链(CsXDH1
‑
asODN)和蔗糖处理后的样品)和对照组的样品(用蔗糖处理后的样品)通过微波固定2min，然后在60℃烘箱中彻底干燥后磨碎，过30目筛后保存于4℃冰箱中，用于生化检测。
[0023]生化检测的方法：实验组和对照组的茶叶样品采用浸提法提取嘌呤生物碱物质。称取0.2g(精确到0.0001g)的样品于10mL离心管中，加入5mL在70℃水浴锅中预热过的超纯水，摇匀使试样充分湿润；移入70℃水浴锅中浸提10min(每隔5min搅拌一次)，浸提完毕后冷却至室温，转入离心机在3500r/min转速下离心，将上清液转移至10mL容量瓶。残渣用4mL超纯水再提取一次，重复以上操作。合并提取液定容至刻度，摇匀后得到样品提取液。样品提取液经0.22μm膜过滤后上样至高效液相色谱仪1220In1inityⅡLC(安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州)进行物质检测。咖啡碱和可可碱标准品购自飞宇生物技术有限公司(中国江苏)，黄嘌呤标准品购自阿米达生物科技有限公司(中国重庆)。乙腈、冰乙酸均为HPLC级，使用前经0.22μm膜过滤。色谱条件如下：色谱柱采用Agilent ZORBAX SB
‑
C18(5μm,4.6*250mm)；紫外检测波长设置为274nm；流动相A为0.2％冰乙酸；流动相B为乙腈；流速为0.9mL/min；柱温箱温度为25℃；每次进样量为20μL。梯度洗脱程序如下：含8～16％的流动相B，0～10min；含16～20％的流动相B，10～20min；含20～8％的流动相B，20～25min；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种反义寡核苷酸链，其特征在于，所述反义寡核苷酸链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的反义寡核苷酸链在沉默茶树黄嘌呤脱氢酶基因或干扰嘌呤生物碱代谢方面的应用。3.一种权利要求2所述的反义寡核苷酸链沉默茶树黄嘌呤脱氢酶基因或干扰嘌呤生物碱代谢的方法，其特征在于，所述方法具体为：将所述反义...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴致君，唐千惠，曾亮，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：