本发明专利技术公开了一种来源于香菇的真菌漆酶基因、真菌漆酶及其在降解四环素类抗生素中的应用。所述真菌漆酶LeLAC12的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因真菌漆酶基因LeLAC12的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述真菌漆酶LeLAC12耐酸，最适pH为3.0，在pH＝2.0～6.0范围内具有较好的稳定性；最适温度为30℃，能够耐受高温，在70℃条件下处理12h仍能保持37％的酶活。所述真菌漆酶LeLAC12可用于酸性、高温等条件下四环素类抗生素污染物的去除，将环境中的四环素类抗生素降低到安全水平，减少抗生素抗药基因的产生和传播，具有较高的应用价值。价值。价值。
【技术实现步骤摘要】
一种来源于香菇的真菌漆酶基因、真菌漆酶及其在降解四环素类抗生素中的应用
[0001]本专利技术属于生物蛋白酶
，具体涉及一种来源于香菇的真菌漆酶基因、真菌漆酶及其在降解四环素类抗生素中的应用。
技术介绍
[0002]四环素类抗生素是一种广谱抗生素，在畜牧养殖行业中大量应用，是我国使用量最大的抗生素之一。过量使用的抗生素进入环境中，使细菌的耐药性增强，产生耐药基因，因此，四环素类抗生素已经成为一种新型污染物，引起日益严重的环境问题。
[0003]目前处理环境中抗生素的方法主要有物理法、化学法和生物法，其中物理法是对污染物的转移，并不能完全去除，化学法可能会引入新的污染物，且对反应条件有一定的要求，只有生物法是一种反应条件温和，无副作用的方法。
[0004]漆酶是一类含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶，能够降解酚类及其衍生物、芳胺类及其衍生物、羧酸及其衍生物、色素和金属有机物，能够催化氧化多环芳烃、多氯联苯、除草剂、杀虫剂、抗生素等环境中难降解有机污染物的降解。
[0005]目前报道的漆酶大多来源于细菌。真菌基因组中也蕴藏丰富的漆酶基因，跟细菌相比，真菌漆酶的表达不需要诱导，表达更稳定，真菌漆酶大多为胞外酶，蛋白纯化过程更简单。分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌、子囊菌及半知菌等高等真菌中，不同种属的真菌漆酶酶学性质和产漆酶能力具有较大差异。
[0006]真菌漆酶大多为单体胞外糖蛋白，分子量在38～150kDa之间。截至目前，对奥德蘑属分离到漆酶的研究较少，只分离到一个41KDa大小的漆酶。在真菌种类中存在多种漆酶同工酶，平菇中有6个漆酶被克隆，金针菇中显示出有11个漆酶。真菌生长过程中会经过不同的发育阶段，包括菌丝、子实体等，这解释了在同一物种中可能存在不同的漆酶同工酶。香菇又称花菇、冬菇，是一种味道鲜美，营养丰富的食用菌，但目前对于香菇中漆酶基因并对其进行体外克隆表达及功能研究的报道较少。本专利技术从香菇菌株的胞外酶中分离得到一个新的漆酶，通过基因克隆、异源表达、蛋白纯化等过程得到漆酶，该漆酶与已经报道的氨基酸序列(AAG27433from Lentinus sajor
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caju)同源性最高为59.69％，在四环素类抗生素降解方面具有较大的应用前景。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的之一是提供一种来源于香菇的真菌漆酶基因LeLAC12。
[0008]本专利技术的另一个目的是提供一种真菌漆酶LeLAC12。
[0009]本专利技术的另一个目的是提供真菌漆酶LeLAC12在降解四环素类抗生素中的应用。
[0010]本专利技术从香菇菌株的胞外酶中分离得到一个新的漆酶，通过基因克隆、异源表达、蛋白纯化等过程得到漆酶，并将其应用于降解环境中四环素类抗生素。
[0011]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0012]本专利技术提供了一种来源于香菇的真菌漆酶LeLAC12，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
[0013]进一步的，所述真菌漆酶LeLAC12的最适pH为3.0，在pH＝2.0～6.0范围内具有较好的酶活稳定性。
[0014]进一步的，所述真菌漆酶LeLAC12的最适酶活温度为30℃。
[0015]本专利技术还提供了一种来源于香菇的真菌漆酶基因LeLAC12，其为所述的真菌漆酶LeLAC12的编码基因，其具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0016]进一步的，所述真菌漆酶基因LeLAC12来源于香菇菌株，具体为香菇菌株Lentinula edodes L808。
[0017]本专利技术还提供了一种包含所述的真菌漆酶基因LeLAC12的重组菌株。
[0018]进一步的，所述重组菌株采用的是毕赤酵母。
[0019]本专利技术还提供了所述的真菌漆酶LeLAC12、或者所述的真菌漆酶基因LeLAC12、或者所述的重组菌株在降解四环素类抗生素中的应用。
[0020]进一步的，所述的四环素类抗生素为土霉素、金霉素、四环素、强力霉素中的至少一种。
[0021]进一步的，所述真菌漆酶LeLAC12降解四环素类抗生素的pH为2.0
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6.0，反应温度为20℃
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70℃。
[0022]进一步的，所述真菌漆酶LeLAC12降解四环素类抗生素的最适pH为3.0，最适反应温度为30℃。
[0023]本专利技术与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
[0024]本专利技术所述的漆酶LeLAC12来源于真菌香菇Lentinula edodes L808，是香菇的胞外酶。与已有的漆酶相比，所述真菌漆酶对四环素类抗生素有较好的降解效果，在四环素初始浓度为50mg/L的条件下4小时降解效率为96.8％，可用于环境中四环素类抗生素的去除。所述真菌漆酶适用于酸性条件(最适pH为3.0)，在pH＝2.0～6.0范围内具有较好的酶活稳定性；最适酶活温度为30℃，能够耐受较高的温度，在70℃条件下处理12小时仍能保持37％的酶活。因此，本专利技术所述真菌漆酶LeLAC12可用于酸性、高温条件下四环素类污染物的去除，具有广阔的应用场景。
附图说明
[0025]图1为真菌漆酶基因PCR扩增产物的琼脂凝胶电泳图谱。
[0026]图2为纯化得到的真菌漆酶的SDS
‑
PAGE电泳图。
[0027]图3真菌漆酶的pH稳定性。
[0028]图4温度对真菌漆酶活力的影响。
[0029]图5真菌漆酶对四环素降解的效果。
[0030]图6不同四环素浓度及漆酶处理后对大肠杆菌生长状况的影响。
[0031]图7不同四环素浓度及漆酶处理后对芽孢杆菌生长状况的影响。
具体实施方式
[0032]结合以下具体实例对本专利技术的技术方案作进一步详细的说明。
[0033]下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学试剂公司购买。下述实施例中，所有分子生物学操作均参考“分子克隆实验指南”(科学出版社，2002版)进行。
[0034]MD培养基(1L)：YNB 13.4g，葡萄糖10g，用蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌20min，后加入500
×
B生物素2mL。
[0035]YPD培养基(1L)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，用蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌20min。
[0036]BMGY液体培养基(1L)：YNB 13.4g，酵母粉10g，蛋白胨20g，甘油10g，用0.1M pH6.0磷酸盐缓冲液定容至1L，121℃高压灭菌20min，后加入500
×
B生物素2mL。
[0037]实施例1：真菌漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达与制备
[0038](1)真菌漆酶基因的克隆
[0039]利用真核生物RNA提取试剂盒提取香菇Lentinul本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种来源于香菇的真菌漆酶LeLAC12，其特征在于：所述真菌漆酶LeLAC12具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。2.一种来源于香菇的真菌漆酶基因LeLAC12，其特征在于：所述真菌漆酶基因LeLAC12为权利要求1所述的真菌漆酶LeLAC12的编码基因，其具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的真菌漆酶基因LeLAC12，其特征在于：所述真菌漆酶基因LeLAC12来源于香菇菌株，具体为香菇菌株Lentinula edodes L808或者Lentinula edodes W1
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26。4.一种包含权利要求2所述的真菌漆酶基因LeLA...
【专利技术属性】
技术研发人员：于浩，胡春辉，胡景田，赵书雪，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：
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