一种特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的药物及制备方法和应用技术

本发明专利技术属于异性灭活结核分枝杆菌技术领域，具体涉及一种特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的药物及制备方法和应用。选用HigA为靶点设计特异性脱氧核酶并将脱氧核酶与小肽进行偶联，并采用锁核酸来增强脱氧核酶的效能，提供靶向治疗结核的小肽偶联的、特异切割结核杆菌HigA mRNA的锁核酸脱氧核酶及其应用，避免了耐药菌的产生，实现对体内结核分枝杆菌及其耐药菌的清除，药物化学性质稳定，用量少，治疗周期短，该药物不仅能够杀伤活动性结核，还能够杀伤耐药结核且药物本身补诱导结核分枝杆菌发生耐药，在对抗结核病方面有着重大意义。大意义。大意义。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的药物及制备方法和应用


[0001]本专利技术属于异性灭活结核分枝杆菌
，具体涉及一种特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的药物及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]结核病是单一病原体致死率最高的疾病，每年全球大约有200万人死于结核病，有接近1000万新发病例。目前我国结核病年发病人数约为130万，因结核病死亡人数每年达13万，超过其它传染病死亡人数的总和。在各种原因导致的(如艾滋病、衰老、肿瘤等)免疫低下人群中形势更为严峻，据统计在艾滋病患者中每年有50万人死于继发的结核病。我国是结核病高流行区，总数居全球第二，是我国传染病中的第一位死因。更值得关注的是全世界有超过三分之一的人口处于潜伏性结核感染(LTBI)状态，随时都有可能活化为活动性结核。目前结核病治疗方案有：1.化学疗法2.免疫疗法3.基因疗法。
[0003]其中，1.化学疗法存在的问题：(1)对休眠的结核分枝杆菌无效：全球有20亿人存在结核杆菌的潜伏感染，通常一部分活菌会在宿主体内持续终生并随时可能活化增殖，对休眠的结核分枝杆菌进行及时有效的治疗十分困难；(2)诱导耐药菌株的产生：由于抗生素作用靶点的单一性，容易导致耐药菌株的产生。据统计全球每年至少有27.3万耐药结核新发病例，有10％左右的新发结核病例携有MDR株(国内某些省份统计达到11％)，而在曾经治疗过的病人中高达25％；(3)治疗后易复发：抗生素对于结核分枝杆菌杀灭不彻底，体内总是会残留少部分菌，在体内持留状态的Mtb具有活化潜能并可伺机四处播散。Mtb的胞内持留既是潜伏感染形成的基础，也是参与多耐菌株产生以及导致治疗后复发的关键因素；(4)治疗周期长：由于传统的抗结核药物主要通过干扰细菌DNA或细胞壁的合成在细菌繁殖阶段发挥作用，对细胞内增殖缓慢的持留菌无作用，大大延长了抗痨周期，患者往往依从性不高难以坚持。增加了耐药菌株的发生率。(5)毒副作用大：结核病的治疗需要联合，长疗程服药。药物种类经常四种甚至四种以上，疗程至少六个月，1年，长的需要两年甚至更长。在临床上，副反应的发生率是相当的高的，最常见的有肝毒性，胃肠道反应，周围神经炎等，对患者的身体造成了二次伤害；2.免疫治疗存在的问题：(1)半衰期短：目前免疫治疗药物的在体内的半衰期非常短，且其活性易被各种酶干扰，难以应用于临床。(2)药物用量大：由于免疫治疗药物的半衰期短，要使其在体内保持一定的血药浓度就要使用大量的免疫药物。(3)不良反应多：由于直接使用免疫活性因子来调节宿主的免疫反应，易导致过敏反应、机体免疫功能紊乱，引发其他免疫性疾病。(4)治疗费用高：免疫活性因子的制备成本高，储存条件苛刻，有效期短。物治疗周期长，通常一个疗程在2
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4个月，治疗费用高；3.基因治疗存在的问题：(1)治疗成本高：目前基因治疗药物制备成本高，作用靶点单一。(2)药物稳定性不高：药物储存条件要求高，易被体内多种酶降解。(3)药物穿透差：药物不能很好的穿过细胞膜作用于靶基因，导致治疗效果差。
[0004]目前已有的治疗方案远远不能满足如此大的结核病患者基数，所以需要研究新的
治疗方案。
[0005]脱氧核酶(DNAzyme)是一种能专一识别并催化切割RNA的寡脱氧核苷酸分子，其中具有10
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23基序(10
‑
23motif)的脱氧核酶(10
‑
23DNAzyme or10
‑
23deoxyribozyme)被认为最具应用潜力(图2)。小肽是诱导细胞凋亡的群体感应信号，并且可以增加DNAzyme穿膜作用，使药物快速见效，缩短治疗时间。
[0006]毒素
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抗毒素系统(TAS)广泛存在于结核分枝杆菌基因组中，其中包括higBA系统，毒素
‑
抗毒素系统的激活可能会导致细菌耐药或持留性的形成，当结核分枝杆菌在不利的生长条件下，会减少HigA mRNA，使higA蛋白的合成受阻，会造成higB毒素蛋白以游离形式存在，进而导致细菌死亡。因此，若能利用higBA系统调控Mtb的凋亡，将是结核病治疗方面的重大突破。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的不足，本专利技术提供一种特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的药物及制备方法和应用，选用HigA为靶点设计特异性脱氧核酶并将脱氧核酶与小肽进行偶联，并采用锁核酸来增强脱氧核酶的效能，提供靶向治疗结核的小肽偶联的、特异切割结核杆菌HigA mRNA的锁核酸脱氧核酶及其应用，避免了耐药菌的产生，实现对体内结核分枝杆菌及其耐药菌的清除，药物化学性质稳定，用量少，治疗周期短，该药物不仅能够杀伤活动性结核，还能够杀伤耐药结核且药物本身补诱导结核分枝杆菌发生耐药，在对抗结核病方面有着重大意义，从而消除上述
技术介绍
中的技术问题。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：一种特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的锁核酸脱氧核酶，所述锁核酸脱氧核酶对应的编码序列为如下3种的任意一种，名称和序列分别如下所示：
[0009]DR1：GGCGAGGTCGTCAGGCTAGCTACAACGACCCAAAGGG，其为SEQ ID NO:1序列；
[0010]DR2：GAAGCTGGGATCAGGCTAGCTACAACGAGCCGCAATC，其为SEQ ID NO:2序列；
[0011]DR3：CGCAGCGCAATCAGGCTAGCTACAACGAGCGCATCGA，其为SEQ ID NO:3序列。
[0012]进一步的，所述锁核酸脱氧核酶的活性中心域为GGCTAGCTACAACGA。
[0013]进一步的，所述DR1编码序列5
’
端的第5,17,22,26,32位碱基上修饰有锁核酸；
[0014]所述DR2编码序列5
’
端的第3,11,18,24,32位碱基上修饰有锁核酸；
[0015]所述DR3编码序列5
’
端的第5,10,17,21,33位碱基上修饰有锁核酸。
[0016]一种特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的药物，包含上述的锁核酸脱氧核酶，所述药物为锁核酸脱氧核酶与小肽偶联而成。
[0017]进一步的，所述药物靶向结核分枝杆菌HigA mRNA。
[0018]特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的药物的制备方法，
[0019](1)以锁核酸作为脱氧核酶可替代部分的合成原料，以10
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23脱氧核酶结构为基本框架，提取H37Rv的DNA作为模版，设计HigA和HigB的上下游引物进行PCR扩增，用计算机软件模拟HigA
‑
mRNA的二级结构，根据模拟的结构图选择适合的待切割靶点并设计针对相应靶点的特异性锁核酸脱氧核酶；
[0020](2)按10
‑
23脱氧核酶的切割模式针对各候选靶位设计一系列不同底物结合臂长度的相应10<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的锁核酸脱氧核酶，其特征是：所述锁核酸脱氧核酶对应的编码序列为如下3种的任意一种，名称和序列分别如下所示：DR1：5
’‑
GGCGAGGTCGTCAGGCTAGCTACAACGACCCAAAGGG
‑3’
，其为SEQ ID NO:1序列；DR2：5
’‑
GAAGCTGGGATCAGGCTAGCTACAACGAGCCGCAATC
‑3’
，其为SEQ ID NO:2序列；DR3：5
’‑
CGCAGCGCAATCAGGCTAGCTACAACGAGCGCATCGA
‑3’
，其为SEQ ID NO:3序列。2.根据权利要求1所述的特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的锁核酸脱氧核酶，其特征在于：所述锁核酸脱氧核酶的活性中心域为GGCTAGCTACAACGA。3.根据权利要求1所述的特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的锁核酸脱氧核酶，其特征在于：所述DR1编码序列5
’
端的第5,17,22,26,32位碱基上修饰有锁核酸；所述DR2编码序列5
’
端的第3,11,18,24,32位碱基上修饰有锁核酸；所述DR3编码序列5
’
端的第5,10,17,21,33位碱基上修饰有锁核酸。4.一种特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的药物，其特征在于：包含权利要求1
‑
3任一项所述的锁核酸脱氧核酶，所述药物为锁核酸脱氧核酶与小肽偶联而成。5.根据权利要求4所述的特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的药物，其特征在于：所述药物靶向结核分枝杆菌HigA mRNA。6.根据权利要求4
‑
5任一项所述的特异性靶向切割及高效灭活结核分枝杆菌的药物的制备方法，其特征在于：(1)以锁核酸作为脱氧核酶可替代部分的合成原料，以10
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23脱氧核酶结构为基本框架，提取H37Rv的DNA作为模版，设计HigA和HigB的上下游引物进行PCR扩增，用计算机软件模拟HigA
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mRNA的二级结构，根据模拟的结构图选择适合的待切割靶点并设计针对相应靶点的特异性锁核酸脱氧核酶；(2)按10
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23脱氧核酶的切割模式针对各候选靶位设计一系列不同底物结合臂长度的相应10
‑
23锁核酸脱氧核酶序列，计算各10
‑
23锁核酸脱氧核酶的底物结合臂与相应候选靶点的结合自由能ΔG，选择结合自由能在
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20kcal
·
mol(
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l)&lt;ΔG&lt;
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25kcal
·
mol(
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l)范围内的底物结合臂作为针对各候选靶点的10
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23锁核酸脱氧核酶的最适底物结合臂；(3)计算各10
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23锁核酸脱氧核酶自身序列杂交的杂交自由能，从中选择出自身杂交能力较弱的锁核酸脱氧核酶；(4)将筛选...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊正君，付玉荣，郑皖怿，姜吉亮，乔晋娟，孟祥英，葛安山，
申请(专利权)人：潍坊医学院，
类型：发明
国别省市：