一种检测Ⅱ型鸡星状病毒抗体的Cell-ELISA试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种检测Ⅱ型鸡星状病毒抗体的ELISA试剂盒及制备方法，运用感染Ⅱ型鸡星状病毒的LMH细胞进行Cell

【技术实现步骤摘要】
一种检测Ⅱ型鸡星状病毒抗体的Cell
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ELISA试剂盒及制备方法


[0001]本专利技术涉及生生物制品
，具体涉及一种检测Ⅱ型鸡星状病毒抗体的Cell
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ELISA试剂盒和试剂盒的制备方法，用于Ⅱ型鸡星状病毒感染血清学诊断以及抗体水平的监测、流行病学调查等。

技术介绍

[0002]鸡星状病毒(Chicken Astrovirus，CAstV)是一种无囊膜、呈二十面体对称的单股正链RNA病毒，其结构在电镜下显示呈五角或者六角的总状结构，基因组大小约为7.5kb，包括5
’
非编码区、3个开放阅读框(ORF1a、ORF1b、ORF2)、3
’
非编码区和多聚腺苷酸尾。鸡星状病毒是从生长发育迟缓的鸡群中发现的新型肠道病原体，其既可以通过粪口途径进行水平传播，也可以通过母鸡垂直传播给雏鸡，主要侵害幼龄雏鸡，导致雏鸡运行发育迟缓综合征、白雏鸡综合征以及肾脏痛风。
[0003]该病毒在2004才被认定为一个新的物种。2011
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2012年印度商业鸡群爆发痛风，导致肉鸡死亡率高达40％。随后在欧洲、北美等地区又出现了以孵化率降低、雏鸡羽毛苍白虚弱以及死亡率增加为特征的白雏鸡孵化征。近年来，中国CAstV感染呈上升趋势，在大多数省份均存在CAstV感染，最初感染可能不严重，一旦传播流行就会向整个鸡群蔓延，造成大规模爆发，极大危害我国养鸡业的健康发展。
[0004]最初，星状病毒感染的检测是通过电子显微镜(EM)观察病毒粒子的特征性结构——五/六角星形进行鉴定，但此方法依赖于试验人员的显微镜观察以及病毒的培养与储存，具有许多不确定因素。2015年Skibinska等人以杆状病毒表达载体系统产生的衣壳蛋白为抗原建立了ELISA方法，为诊断Ⅰ型鸡星状病毒的感染提供了一种血清学工具。2019年武宗仪等人建立了针对鸡Ⅱ型星状病毒的绝对定量qRT
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PCR检测方法。2022年栾等人为确定临床鸡群痛风的病原，建立了同时检测CAstV、ANV、IBV的多重检测方法。
[0005]目前国内分离株的衣壳蛋白氨基酸同源性与目前已发表国外的分离株差异较大，国内的主要流行株类型为Ⅱ型鸡星状病毒，衣壳蛋白氨基酸序列与英国的FP3毒株同源性较高，可造成发育迟缓以及肾脏疾病，广泛分布于江苏、广东、河北等地区。而我国与对该病毒的生物学特性、致病机制等的研究尚处于起步阶段，目前仍缺少有效的疫苗免疫和预防控制措施，对于国内CAstV流行株—Ⅱ型鸡星状病毒的抗体检测方法的研制仍为空白，因此建立一种廉价、简单、快速的鸡星状病毒抗体检测方法有重要意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术通过基于感染Ⅱ型鸡星状病毒的鸡肝癌细胞系为基础的ELISA实验，建立了一种检测Ⅱ型鸡星状病毒抗体的Cell
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ELISA检测试剂盒及应用，用于鸡星状病毒的血清学诊断、流行病学调查和抗体的监测。
[0007]与传统ELISA方法相比，Cell
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ELISA用细胞代替可溶性抗原包被于96孔细胞培养
板，不需裂解细胞便可直接测量微孔板里的蛋白变化，是基于ELISA原理进行免疫学检测的一种有效方法。适用于抗原位于细胞膜上而相应抗原的特性又不十分清楚或抗原难于纯化等情况。细胞直接在微孔板里培养，在操作过程中，不涉及传统免疫印迹法的制胶，跑胶，转膜，曝光等步骤，并且操作简单，很容易实现多个平行，多次重复，所得数据具有统计分析意义。本专利技术使用感染鸡星状病毒的LMH细胞作为包被抗原，解决了鸡星状病毒抗原难以纯化的问题，省去了制备、纯化抗原等步骤，大大减少了检测方法的时间与成本。
[0008]为实现上述专利技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]一种检测Ⅱ型鸡星状病毒抗体的Cell
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ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包含固定有感染Ⅱ型鸡星状病毒的LMH细胞的细胞微孔板，所述Ⅱ型鸡星状病毒序列的GenBank编号为MK746105.1。
[0010]进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、酶标试剂、样品稀释液、显色液及洗涤液。
[0011]进一步的，所述阳性对照为抗Ⅱ型鸡星状病毒的Balb/c小鼠血清，所述阴性对照为ICR小鼠血清。
[0012]进一步的，所述酶标试剂为辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡IgG抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体，所述样品稀释液为含有3％FBS的PBS，所述显色液为TMB显色液，所述的终止液为2M H2SO4，所述洗涤液为含有0.05％Tween
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20的PBS；封闭液为3％FBS的PBS、封闭条件为37℃2h。
[0013]进一步的，一抗血清稀释度为1:400、血清作用时间为37℃60min；二抗血清稀释度为1：20000、二抗作用时间为37℃60min；显色条件为37℃15min。
[0014]本专利技术还提供上述检测Ⅱ型鸡星状病毒抗体的Cell
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ELISA检测试剂盒制备方法，将Ⅱ型鸡星状病毒CAstV/NJ1701毒株感染LMH细胞，24h后对细胞进行固定、洗涤、透化。
[0015]进一步的，将空斑纯化后的Ⅱ型鸡星状病毒CAstV/NJ1701毒株感染LMH细胞后，对其进行RT
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PCR鉴定，采用的引物序列如下：
[0016]引物名称
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引物序列
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产物大小
[0017]CAstV
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ORF1b
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F
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
ATTGCATGGCTTCACCGTAATCA
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
513bp
[0018]CAstV
‑
ORF1b
‑
R
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
CGGTCCATCCCTCTACCAGATTT
[0019]进一步的，所述LMH细胞系细胞浓度为3
ⅹ
104个细胞/mL，96微孔细胞板，100μl/孔。
[0020]进一步的，Ⅱ型鸡星状病毒CAstV/NJ1701毒株感染量为MOI＝3.0。
[0021]进一步的，LMH细胞系在96微孔细胞板中培养14
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16h后加入CAstV/NJ1701毒株感染，24h后弃培养上清，使用4％多聚甲醛固定细胞20min，用0.25％Triton
‑
X
‑
100/PBS透化细胞，采用含0.05％吐温的PBST洗涤5次后，用封口膜封住96微孔细胞板，放4℃储存备用。
[0022]上述Cell
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ELISA检测试剂盒在Ⅱ型鸡星状病毒的流行病学调查中的应用也是本专利技术的保护范围；
[0023]进一步的，所述检测方法包括以下步骤：
[0024](1)细胞固定及透化：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测Ⅱ型鸡星状病毒抗体的Cell
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ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含固定有感染Ⅱ型鸡星状病毒的LMH细胞的细胞微孔板，所述Ⅱ型鸡星状病毒序列的GenBank编号为MK746105.1，所述Ⅱ型鸡星状病毒为空斑纯化后的Ⅱ型鸡星状病毒。2.根据权利要求1所述的检测Ⅱ型鸡星状病毒抗体的Cell
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ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、酶标试剂、样品稀释液、显色液及洗涤液。3.根据权利要求2所述的检测Ⅱ型鸡星状病毒抗体的Cell
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ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为抗Ⅱ型鸡星状病毒的Balb/c小鼠血清，所述阴性对照为ICR小鼠血清。4.根据权利要求2所述的检测Ⅱ型鸡星状病毒抗体的Cell
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ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标试剂为辣根过氧化物酶标记的山羊抗鸡IgG抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体，所述样品稀释液为含有3％FBS的PBS，所述显色液为TMB显色液，所述的终止液为2M H2SO4，所述洗涤液为含有0.05％Tween
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20的PBS；封闭液为3％FBS的PBS、封闭条件为37℃2h。5.根据权利要求1所述的检测Ⅱ型鸡星状病毒抗体的Cell
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ELISA检测试剂盒，其特征在于，一抗血清稀释度为1:400、血清作用时间为37℃60min；二抗血清稀释度为1：20000、二抗作用时间为37℃60min；显色条件为37℃15min。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱琨，宋睿，钱昊天，秦爱建，邵红霞，叶建强，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：