本发明专利技术提供一种制备与药物化学偶联的细胞结合剂的方法。该方法包括使连接体与细胞结合剂共价连接、纯化步骤、使药物与细胞结合剂缀合和随后的纯化步骤。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
[oooii本专利技术涉及制备相当高纯度和稳定性的缀合物的方法，其中所述缀合物包含与药物化学偶联的细胞结合剂。专利技术技术为了这个目的，噬菌体展示可用于产生这种抗体。在这点 上，应用标准分子生物学和重组DNA技术，可产生编码抗体的抗原结 合可变(V)域的噬菌体文库(参见，例如，Sambrook等(编辑)，Afo/ecw/ar C7ow/"g， 爿丄fl6on^， Afaw /， 第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001))。为了特异性结合期望的抗原， 选择编码具有期望特异性的可变区的噬菌体，并重新构建包含所选可变域的完全人抗体。将编码重构抗体的核酸序列引入适当的细胞系如 用于杂交瘤生产的骨髓瘤细胞中，使得具有单克隆抗体特性的人抗体 由该细胞分泌(参见，例如，Janeway等，上文，Huse等，上文和美国 专利6,265,150)。替代选择地，单克隆抗体可由对特异性人重和轻链 免疫球蛋白基因是转基因的小鼠生产。这样的方法是本领域已知的， 并被描述于例如美国专利5，545，806和5,569,825以及Janeway等，上 文中。0024最优选地，抗体是人源化抗体。本文所用的"人源化，，抗体 是其中小鼠单克隆抗体的互补决定区(CDR)(其形成抗体的抗原结合 环)嫁接在人抗体分子的框架上的抗体。由于小鼠和人抗体框架的相似 性，本领域中公认这种方法产生的单克隆抗体与人抗体是抗原相同的， 但能与产生CDR序列的小鼠单克隆抗体结合相同的抗原。生产人源 化抗体的方法是本领域中众所周知的，并被详细地描述在例如 Janeway等，上文，美国专利5,225,539、 5,585,089和5,693,761 ，欧洲 专利号0239400 Bl，和英国专利号2188638中。也可应用美国专利 5,639,641和Pedersen等，/ Mo/5/o/， "5: 959-973 (1994)中所述的抗 体表面再建技术，产生人源化抗体。尽管本专利技术组合物的缀合物中所 用的抗体最优选为人源化单克隆抗体，但如上所述的人单克隆抗体和 小鼠单克隆抗体也在本专利技术的范围内。具有至少一个抗原结合部位并因此识别和结合位于乾细 胞表面上的至少一个抗原或受体的抗体片断，也在本专利技术的范围内。 在此方面，完整抗体分子的蛋白酶剪切可产生多种抗体片断，所述抗 体片断保留识别和结合抗原的能力。例如用木瓜蛋白酶有限消化抗体 分子一般产生三个片断，其中两个是相同的且称作Fab片断，因为它 们保留母体抗体分子的抗原结合活性。用胃蛋白酶裂解抗体分子正常产生两种抗体片断，其中一种保留了该抗体分子的两个抗原结合臂， 因此称作F(ab')2片断。用二硫苏糖醇或巯基乙胺还原F(ab，)2片断产 生称作Fab'片断的片断。应用常规重组DNA技术，可产生单链可变 区片断(sFv)抗体片断，它由截短的Fab片断组成，所述Fab片断包含 经合成肽与抗体轻链的V域连接的抗体重链的可变(V)域(参见，例如， Janeway等，上文)。类似地，通过重组DNA技术，可制备二硫化物 稳定的可变区片断(dsFv)(参见，例如，Reiter等，五Mgi7i"r/"g， 7, 697-704 (1994))。然而，本专利技术上下文中的抗体片断不限于这些抗 体片断的示例类型。可应用任何适合的能识别和结合期望细胞表面受 体或抗原的抗体片断。抗体片断进一步描述在例如Parham， /. /画w《"/. 2895-2902 (1983)， Spring等/. /附層一 "3.. 470-478(1974)，和Nisonoff等AV 由附."狄230-244 (1960)。应 用本领域已知的任何适用方法例如放射性免疫测定法(RIA) 、 ELISA 、 蛋白质印迹、免疫沉淀法和竟争性抑制测定法，可以测定抗体-抗原结 合(参见，例如，Janeway等，上文，和美国专利申请公布号 2002/0197266 Al)。药物例如氨甲蝶呤、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长 春碱、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、加利车霉素、小管素(tubulysin) 和小管素类似物、倍癌霉素和倍癌霉素类似物、多拉司他汀和多拉司 他汀类似物，也可用于本专利技术的上下文中。多柔比星和柔红霉素化合 物(参见，例如，美国专利6，630，579)也可用作药物。0057药物缀合物可通过体外方法制得。为了连接药物或前体药物至抗体上，应用连接基团。适合的连接基团是本领域众所周知的，包括二硫基、对酸不稳定的基团、对光不稳定的基团、对肽酶不稳定的基团和对酯酶不稳定的基团。优选的连接基团为二硫基。例如，使 用抗体和药物或前体药物之间的二硫化物交换反应可构成缀合物。通过中间载体分子例如血清白蛋白，药物分子也可与细胞结合剂连接。 该分析结果数据描述于表6中。表6:药物缀合物产物相对于pH的特性<table>table see original document page 37</column></row><table>如表7中描述的结果所证明的，在本专利技术上下文中可除去 纯化修饰的抗体的步骤。实施例7第五缀合物样品应用CHT树脂柱(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)纯化，所述柱在50 mM磷酸钠(pH 6.5)中平衡，并用0.3 M NaCl和50 mM磷酸钠(pH 6.5)洗脱。除CHT(陶瓷羟磷灰石)之外，在相似色谦法条件下也可应 用CFT(陶瓷氟磷灰石)。替代选择地，CHT和CFT树脂二者都可用于非吸附的方式，使得期望的产物(实质上单体缀合物)不被该树脂保 留，而保留高分子量种类，因而与期望的产物分离。在描述本专利技术的上下文中(尤其在下列权利要求的上下文 中)应用术语"a"和"an"和"the，，和相似指代，均应被解释为涵盖单数和 复数，除非本文另外指明或明显与上下文相矛盾。术语"包含，，、"具有"、 "包括"和"含有"，除非另外注明均应被解释为开放式术语(即意指"包 括但不限于，，)。本文列举的值范围除非本文另外指明，仅仅旨在用作 个别表示落在这个范围的各个单独值的速记方法，各个单独的值被并 入说明书中，如同本文个别地列举一样。本文所述的所有方法可以以 任何合适的次序进行，除非本文另外指明或另外明显与上下文相矛盾。 本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如,"例如")的应用仅仅旨 在更好地阐释本专利技术而不形成对本专利技术范围的限制，除非另外声明。:明所必需的。 [0119j本文描述了本专利技术的优选实施方案，包括专利技术人已知的实 施本专利技术的最好方式。本领域普通技术人员在阅读上述说明后，那些 优选的实施方案的变化可变得明显。专利技术人预期技术人员适当时应用 这样的变化，专利技术人打算以本文明确描述以外的方式实施本专利技术。因此，本专利技术包括可适用法律允许的在此所附权利要求中所述的主题的 所有修饰和等同物。而且，上述要素以其所有可能变化的任何组合都 包括在本专利技术中，除非本文另外指明或另外明显与上下文相矛盾。权利要求1.制备细胞结合剂-药物缀合物的方法，该方法包括下列步骤(a)用双功能交联试剂接触细胞结合剂，以使连接体与细本文档来自技高网...
【技术保护点】
制备细胞结合剂－药物缀合物的方法，该方法包括下列步骤： （ａ）用双功能交联试剂接触细胞结合剂，以使连接体与细胞结合剂共价连接，从而制备第一混合物，该混合物包含其上结合了连接体的细胞结合剂， （ｂ）使第一混合物经受切向流过滤、选择性沉淀、吸附过滤或吸附色谱法树脂，从而制备纯化的其上结合了连接体的细胞结合剂的第一混合物， （ｃ）通过在ｐＨ为大约４至大约９的溶液中使其上结合了连接体的细胞结合剂与药物起反应，以制备第二混合物，该混合物包含（ｉ）通过连接体与药物化学偶联的细胞结合剂，（ｉｉ）游离药物和（ｉｉｉ）反应副产物，来使药物与纯化的第一混合物中其上结合了连接体的细胞结合剂缀合，以及 （ｄ）使第二混合物经受切向流过滤、选择性沉淀、吸附过滤或吸附色谱法树脂，以从第二混合物的其它成分中纯化通过连接体与药物化学偶联的细胞结合剂，从而制备纯化的第二混合物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：戴勇，王勇，晋圣瑾，DH梅舒拉姆，GW阿姆弗莱特，
申请(专利权)人：免疫原公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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