一种日本沼虾Ⅰ型甲壳素（Crustin）基因的免疫功能分析方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种日本沼虾Ⅰ型甲壳素(Crustin)基因的免疫功能分析方法及应用。本发明专利技术首次克隆出了日本沼虾2种Ⅰ型甲壳素(Crustin)基因，并利用体内抗病原体感染以及RNA干扰(RNAi)合并病原体感染的技术方法分析了这2种Crustin基因的免疫功能。利用基因的体外重组表达技术获得了这2种Crustin的重组蛋白，它们具有体外抗菌的生物活性，另外注射脂质体包裹的这2种Crustin的重组蛋白可降低感染了病原体的日本沼虾的死亡率。该发明专利技术对日本沼虾养殖中病害的防治有实际应用价值。沼虾养殖中病害的防治有实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种日本沼虾Ⅰ型甲壳素(Crustin)基因的免疫功能分析方法及应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体为一种日本沼虾Ⅰ型甲壳素(Crustin)基因的免疫功能分析方法及应用。

技术介绍

[0002]抗菌肽(AMP)是一类保守的多肽家族，在多细胞生物的先天免疫系统中起着重要作用。由于AMP对革兰氏阳性和阴性细菌、真菌以及一些病毒和原生动物病原体具有抗性，它们被认为是开发新抗生素的合适的候选物。由于缺乏高度特异性的适应性免疫系统，甲壳动物主要通过先天免疫来对抗外来病原体。在甲壳动物中发现了许多AMP，其中甲壳素(Crustin)是一种具有乳清酸性蛋白(WAP)结构域的阳离子AMP，它是一种多功能分子，在生理创伤或应激恢复过程中具有蛋白酶抑制、抗菌和免疫调节活性。第一个Crustin从普通滨蟹(Carcinus maenas)的血细胞中被鉴定出来，命名为carcinin，它是一种阳离子疏水蛋白，分子量为11.5kDa，对革兰氏阳性耐盐细菌或海洋细菌具有特异活性。之后，许多Crustin和类似Crustin的肽陆续从其他各种甲壳类动物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种日本沼虾Ⅰ型甲壳素(Crustin)基因的免疫功能分析方法及应用，其特征在于：具体包括以下步骤：步骤一：从中国河南省新乡市延津县的护城河中捕获健康成年日本沼虾，在装有充分曝气的循环水的水族箱中，26℃下在实验室中暂养15天后进行实验；步骤二：基因克隆及鉴定：使用总RNA提取试剂盒Ⅱ(Omega,美国)从日本沼虾的鳃中提取总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳确认RNA完整性，其质量和浓度由Nanodrop2000超微量分光光度计(Thermo,美国)测定；按照RACE5'/3'Kit(Clontech,日本)说明书的方案，采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法并结合巢式PCR技术，克隆出2种甲壳素(Crustin)基因(命名为MnCrustin1和MnCrustin2基因)的全长cDNA序列。3'端特异性引物和5'端特异性引物使用Primer Premier 5.0进行设计。利用生物信息学方法对克隆出的MnCrustin1和MnCrustin2基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析，并根据序列的结构特征对MnCrustin1和MnCrustin2的类型进行鉴定；步骤三：MnCrustin1和MnCrustin2基因的免疫功能分析：包括体内病原体感染后MnCrustin1和MnCrustin2基因表达的变化分析以及RNA干扰(RNAi)合并病原体感染后日本沼虾死亡率变化分析；步骤四：MnCrustin1和MnCrustin2的重组表达及纯化：合成MnCrustin1和MnCrustin2编码区的DNA序列，并克隆到质粒pET28a中；将重组质粒pET28a
‑
MnCrustin1和pET28a
‑
MnCrustin2转化到感受态细胞Escherichia coliRosetta(DE3)中，加入终浓度为1.0mM的异丙基
‑
β
‑
D
‑
硫代半乳糖(IPTG),在37℃下培养4h；8000
×
g离心30min收集细菌，重悬细菌，然后在冰浴中超声破碎30min后再次离心收集上清蛋白；最后用His
‑
bind亲和柱分离纯化MnCrustin1和MnCrustin2重组蛋白(rMnCrustin1和rMnCrustin2)，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS
‑
PAGE)对纯化蛋白进行鉴定，以非IPTG诱导菌为阴性对照，最后将重组蛋白的终浓度调整为2mg/mL；步骤五：rMnCrustin1和rMnCrustin2的应用：包括重组蛋白的体外抗菌生物活性检测和体内注射重组蛋白对日本沼虾抵抗病原体感染的保护作用应用分析；步骤六：统计分析：数据以平均值
±
标准误表示；采用单因素方差分析和独立样本t检验分析两组数据间的显著性差异；P<0.05和P<0.01分别被认为有统计学意义上的显著差异和极显著性差异；采用IBM SPSS Statistics 20.0和GraphPad Prism 5.0软件进行统计作图。2.如权利要求1所述的一种日本沼虾Ⅰ型甲壳素(Crustin)基因的免疫功能分析方法及应用，其特征在于：所述步骤一中成年日本沼虾体重为2
‑
3g以及体长为4
‑
5cm。3.如权利要求1所述的一种日本沼虾Ⅰ型甲壳素(Crustin)基因的免疫功能分析方法及应用，其特征在于：所述步骤二中所用的生物信息学分析方法为用BLAST在线程序检测核苷酸和氨基酸序列的相似性；由开放阅读框(ORF)在线查找工具进行ORF区预测；利用SMART在线程序对蛋白的信号肽序列和结构域进行预测；用ScanProsite在线工具预测蛋白结构中的二硫键。4.如权利要求1所述的一种日本沼虾Ⅰ型甲壳素(Crustin)基因的免疫功能分析方法及应用，其特征在于：所述步骤三中MnCrustin1和MnCrustin2基因的免疫功能分析，具体包括以下步骤：
S1、体内病原体感染后MnCrustin1和MnCrustin2基因表达的变化分析：将日本沼虾随机分为3组：对照组和2个病原体感染组，病原体感染组每只虾肌肉注射50μL嗜水气单胞菌混悬液(1
×
106CFU/mL)或50μL白斑综合症病毒(white spot syndrome virus，WSSV)混悬液(1
×
106拷贝/mL)，对照组注射50μLPBS溶液；在注射后的0、4、8、12、24、36、48和72h每组随机选取6只虾，并对日本沼虾的血细胞、鳃和肝胰腺进行取样，然后用总RNA提取试剂盒Ⅱ(Omega,美国)提取各组织RNA，病原体感染后MnCrustin1和MnCrustin2基因表达的变化利用实时荧光定量PCR(qRT
‑
PCR)方法进行检测；S2、RNAi合并病原体感染后日本沼虾死亡率变化分析：通过体外转录法生成MnCrustin1和MnCrustin2基因的双链RNA(dsRNA)(dsMnCrustin1和dsMnCrustin2)以及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的dsRNA(dsEGFP)。将健康日本沼虾分为dsMnCrustin1组、dsMnCrustin2组、dsEGFP组和PBS对照组；每组分别注射50μL(5μg)的dsMnCrustin1、dsMnC...

【专利技术属性】
技术研发人员：江红霞，刘雪巍，李欢欣，李屹峥，张帅帅，张冉，李玉华，张猛，王磊，于淼，乔志刚，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
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