一种检测高毒力肺炎克雷伯菌的荧光定量PCR引物组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种检测高毒力肺炎克雷伯菌的荧光定量PCR引物组、试剂盒及应用。本发明专利技术针对高毒力肺炎克雷伯菌中编码铁摄取系统相关基因iucA、iroB，代谢转运相关基因peg

【技术实现步骤摘要】
NO:8所示，或与上述序列相似性大于75％的序列；用于检测peg
‑
344的引物为F3/R3，如SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10所示，或与上述序列相似性大于75％的序列；用于检测rmpA的引物为F4/R4，如SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:12所示，或与上述序列相似性大于75％的序列。
[0008]本专利技术同时提供一种检测高毒力肺炎克雷伯菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括和模板DNA。上述和模板DNA。上述包括引物、SYBR Green I或EvaGreen荧光染料、DNA聚合酶、dNTPs、Mg
2+
；上述模板DNA为待测菌液的基因组DNA。
[0009]优选的，上述试剂盒中各引物终浓度分别为0.1
‑
0.6μM。
[0010]优选的，上述试剂盒中引物F1/R1终浓度分别可选0.2μM或0.3μM，引物F2/R2终浓度可选0.2μM，引物F3/R3终浓度可选0.2μM，引物F4/R4终浓度可选0.5μM。
[0011]更优选的，上述试剂盒中，可选用20μL扩增反应体系，其包含更优选的，上述试剂盒中，可选用20μL扩增反应体系，其包含10μL，模板DNA 2μL，其余用灭菌ddH2O补足。
[0012]上述试剂盒，所述荧光定量PCR反应程序为：第一阶段：预变性95℃/5min，第二阶段：95℃/30sec，58℃/30sec，共40个循环，第三阶段：65℃
–
95℃，0.1℃/sec升温直至95℃。
[0013]上述试剂盒，所述读取结果为：熔解曲线峰出现在87.5℃附近、85.0℃附近、76.0℃附近或78.5℃附近，说明样品中含有高毒力相关基因iucA、iroB、peg
‑
344或rmpA，则该菌株可判定为高毒力肺炎克雷伯菌。
[0014]本专利技术具有如下有益效果：本方法采用闭管反应，基于熔解曲线峰进行结果判定，检测完毕直接处理，避免开盖造成气溶胶污染，可以快速、准确地进行高毒力肺炎克雷伯菌的检测。
附图说明
[0015]图1高毒力相关基因iucA、peg
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344双重荧光定量PCR熔解曲线
[0016]图2高毒力相关基因iroB、peg
‑
344双重荧光定量PCR熔解曲线
[0017]图3高毒力相关基因iucA、rmpA双重荧光定量PCR熔解曲线
[0018]图4荧光定量PCR方法特异性评价
具体实施方式
[0019]为更好的理解本专利技术，下面的实施例是对本专利技术的进一步说明，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1：高毒力相关基因iucA、peg
‑
344双重荧光定量PCR检测
[0020](1)引物设计与制备
[0021]基于iucA特异性1725bp序列，如SEQ ID NO:1所示和peg
‑
344特异性903bp序列，如SEQ ID NO:3所示，限定引物长度为18
‑
24nt，使用引物设计相关软件或网站进行检索，选取评分较高的引物，iucA特异性引物序列如SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6所示，peg
‑
344特异性引物序列如SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10所示。
[0022]引物由生物工程合成相关公司负责合成、纯化与确证。
[0023](2)肺炎克雷伯菌DNA提取
[0024]用微量移液器吸取2mL菌液于离心管，12000rpm高速离心2min，弃去上清。
[0025]向菌体沉淀中加入200μL的缓冲液，用枪头吹打使菌体彻底悬浮。
[0026]向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。
[0027]向管中加入220μL的缓冲液，振荡15s，置于70℃金属孵育器10min，简短离心去除管盖内壁的水珠。
[0028]向管中加入220μL的无水乙醇，振荡15s。
[0029]将上一步所得的溶液和沉淀加入到吸附柱中，吸附柱放入到收集管中，静置3
‑
5min使得DNA充分被吸附柱吸附，12000rpm高速离心1min，弃去收集管中的废液。
[0030]将吸附柱放入收集管中，加入500μL缓冲液，12000rpm离心1min，弃去废液，将吸附柱放入到收集管中。
[0031]向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃去废液，并重复操作1次。
[0032]将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，弃去废液，取出吸附柱置于室温15min，彻底晾干残余的漂洗液。
[0033]将晾晒干的吸附柱放入已灭菌的2mL离心管中，向吸附柱中悬空加入100μL的洗脱缓冲液，即得待测基因组DNA。
[0034](3)肺炎克雷伯菌DNA的PCR扩增与熔解曲线分析
[0035]反应总体系为20μL，包括10μLDNA模板2μL、灭菌ddH2O 8μL，其中iucA、peg
‑
344引物终浓度均为0.2μM。
[0036]反应程序为：第一阶段：预变性95℃/5min，第二阶段：95℃/30sec，58℃/30sec，共40个循环，第三阶段：65℃
–
95℃，0.1℃/sec升温直至95℃。
[0037]结果判读为：熔解曲线的峰出现在87.5℃附近或76.0℃附近，说明样品中含有高毒力相关基因iucA或peg
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344，则该菌株可判定为高毒力肺炎克雷伯菌。实施例2：高毒力相关基因iroB、peg
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344双重荧光定量PCR检测
[0038](1)引物设计与制备
[0039]基于iroB特异性1116bp序列，如SEQ ID NO:2所示和peg
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344特异性903bp序列，如SEQ ID NO:3所示，限定引物长度为18
‑
24nt，使用引物设计相关软件或网站进行检索，选取评分较高的引物，iroB特异性引物序列如SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8所示，peg
‑
344特异性引物序列如SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10所示。
[0040]引物由生物工程合成相关公司负责合成、纯化与确证。
[0041](2)肺炎克雷伯菌DNA提取
[0042]用微量移液器吸取2mL菌液于离心管，12000rpm高速离心2min，弃去上清。
[0043]向菌体沉淀中加入200μL的缓冲液，用枪头吹打使菌体彻底悬浮。
[0044]向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。
[0045]向管中加入220μL的缓冲液，振荡15s，置于70℃金属孵育器10min，简短离心去除管盖内壁的水珠。
[0046]向管中加入220μL的无水乙醇，振荡15s。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测高毒力肺炎克雷伯菌荧光定量PCR的引物，所述高毒力相关基因分别为iucA、iroB、peg
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344和rmpA，其特征在于，所述引物基于iucA特异性1725bp序列，如SEQ ID NO:1所示；基于iroB特异性1116bp序列，如SEQ ID NO:2所示；基于peg
‑
344特异性903bp序列，如SEQ ID NO:3所示；基于rmpA特异性633bp序列，如SEQ ID NO:4所示；或与上述序列相似性大于75％的序列作为检测序列设计得到。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，用于检测iucA的引物为F1/R1，如SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6所示，或与上述序列相似性大于75％的序列；用于检测iroB的引物为F2/R2，如SEQ ID NO:7/SEQ ID NO:8所示，或与上述序列相似性大于75％的序列；用于检测peg
‑
344的引物为F3/R3，如SEQ ID NO:9/SEQ ID NO:10所示，或与上述序列相似性大于75％的序列；用于检测rmpA的引物为F4/R4，如SEQ ID NO:11/SEQ ID NO:12所示，或与...

【专利技术属性】
技术研发人员：李成龙，杜向党，许春燕，姚红，武一帅，邢梦然，赵莉莹，覃璐，孙佳蕊，崔静宇，杜姊娴，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：