一种TEMPO修饰的交联漆酶聚集体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种TEMPO修饰的交联漆酶聚集体及其制备方法与应用，涉及生物酶工程技术领域。本发明专利技术具体主要是选用漆酶、丙烯酸酯类交联剂、4

【技术实现步骤摘要】
一种TEMPO修饰的交联漆酶聚集体及其制备方法与应用


[0001]本申请涉及生物酶工程
，具体涉及一种TEMPO修饰的交联漆酶聚集体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]漆酶是一类以铜为催化中心的多铜氧化酶，具有强的氧化还原能力且作用的底物广泛，唯一副产物是水，对环境十分友好。然而游离漆酶在工业环境中遇到复杂环境，容易造成酶的活性及稳定性降低。固定化酶技术的出现，一定程度上改善部分游离酶催化效率低、难以重复使用、缺乏稳定性等不足。常见的固定化酶技术分为两类，有载体固定化酶技术和无载体固定化酶技术。有载体固定化酶技术，载体的体积一定程度上限制了酶活性，以及载体引入增加了生产成本。无载体固定化酶技术可以改善这个缺点，其中交联酶聚集体(CLEAs)是最为成熟的一种无载体固定化技术。交联酶聚集体(CLEAs)包括两步，首先是酶通过沉淀剂使得酶物理聚集，再与交联剂通过化学交联制得交联酶聚集体(JournalofMolecular Catalysis B:Enzymatic,2010,62:48
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142)。
[0003]漆酶在工业领域和合成化学领域有着巨大潜力，天然漆酶对于非酚类底物的氧化通常需要在介质参与下发生反应。其中漆酶对于醇氧化反应，已有研究利用TEMPO和游离漆酶催化醇的氧化(Tetrahedron Letters,2001,42:553
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7551)。然而，游离漆酶在反应过程中不稳定、不能回收利用，且2,2,6,6
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氧自由基(TEMPO)也不能回收利用大大限制了其工业应用。近年，有报道对漆酶和介质在多孔材料中进行共固定化，实现可回收利用。但是，这种固定化方法存在载体对酶和底物的接触阻碍问题，使得酶催化效率受到影响(ChemCatChem,2018,10:1542
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1546)。目前，利用漆酶和TEMPO共固定化合成催化材料催化醇氧化的研究尚未开展。

技术实现思路

[0004]针对以上问题，本专利技术目的是提供一种TEMPO修饰的交联漆酶聚集体及其制备方法，该方法提高了漆酶的环境耐受性及稳定性，同时应用于催化醇氧化，实现漆酶和TEMPO的可重复使用性，及高效催化。
[0005]为实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]一种TEMPO修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，包括以下步骤：
[0007](1)将漆酶分散于去离子水中，过滤去除不溶物，获得粗酶溶液；
[0008](2)在搅拌条件下，将粗酶溶液加入到沉淀剂中沉淀，搅拌，然后加入丙烯酸酯类交联剂溶液进行反应，反应结束后离心、洗涤，获得交联漆酶聚集体；
[0009](3)将交联漆酶聚集体分散于溶剂中，获得交联漆酶聚集体分散液；在搅拌条件下，向交联漆酶聚集体分散液中加入4
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氧自由基溶液进行迈克尔加成反应，反应结束后离心、洗涤，获得所述TEMPO修饰的交联漆酶聚集体。
[0010]在专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)中，漆酶与去离子水的质量比为1:10～1:
15。
[0011]在专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)中，沉淀剂选自丙酮、异丙醇、乙腈中的一种，粗酶溶液与沉淀剂的体积比为1:3～1:6；搅拌条件为常温下搅拌1min～10min。
[0012]在专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)中，丙烯酸酯类交联剂为二丙二醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、双三羟甲基丙烷四丙烯酸酯、聚二季戊四醇六丙烯酸酯化合物中的至少一种；丙烯酸酯类交联剂溶液是将丙烯酸酯类交联剂溶于溶剂中制备得到，所述丙烯酸酯类交联剂溶液的浓度为20～100mmol/L；丙烯酸酯类交联剂溶液与粗酶溶液体积比为1:2～1:5；所述反应条件为25～35℃水浴中恒温反应10～19h。优选地，所述溶剂选自任何可以溶解丙烯酸酯类交联剂的溶剂，包括但不限于异丙醇、乙腈、丙酮、甲苯、二甲苯、三甲苯、醋酸丁酯。
[0013]在专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)中，4
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氧自由基溶液与交联漆酶聚集体分散液的体积比为1:3～1:9；所述交联漆酶聚集体分散液是将交联漆酶聚集体分散于溶剂中得到，所述交联漆酶聚集体与溶剂的质量体积比为10mg:1mL～50mg:1mL。进一步优选地，所述溶剂选自丙酮、异丙醇、乙腈中的一种；更优选地，所述溶剂选自异丙醇。4
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氧自由基溶液是将4
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氧自由基溶于异丙醇中制备得到，所述4
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氧自由基溶液的浓度为10～40mmol/L；所述迈克尔加成反应的条件为25～35℃水浴中恒温反应5～10h。
[0014]在专利技术的一种实施方式中，步骤(2)和步骤(3)中离心条件为5000～10000rpm下离心5～10min，洗涤条件为异丙醇洗涤2～5次。
[0015]本专利技术还提供一种采用上述方法制备得到的TEMPO修饰的交联漆酶聚集体。
[0016]本专利技术还提供一种TEMPO修饰的交联漆酶聚集体的应用，其特征在于，将所述的TEMPO修饰的交联漆酶聚集体应用于催化醇氧化反应。
[0017]在专利技术的一种实施方式中，所述TEMPO修饰的交联漆酶聚集体的应用，包括以下步骤：将所述的TEMPO修饰的交联漆酶聚集体分散于去离子水中，获得TEMPO修饰的交联漆酶聚集体分散液，所述TEMPO修饰的交联漆酶聚集体与去离子水的质量比为1:30～1:50；直接加入苯甲醇到所述的TEMPO修饰的交联漆酶聚集体分散液中，在30～60℃水浴中恒温反应10～20h，反应结束后即得苯甲醛。苯甲醛的转化率可利用核磁共振氢谱测定。优选的，所述TEMPO修饰的交联漆酶聚集体分散液与苯甲醇的体积比为60:1～120:1。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019](1)本专利技术所提供一种TEMPO修饰的交联漆酶聚集体较游离酶相比，采用新型丙烯酸酯类交联剂后，交联漆酶聚集体活性具有较高的酶活性保留，时间稳定性及温度耐受性具有显著提高。该催化材料用于醇氧化的催化过程中突出可重复使用性，可工业化应用。
[0020](2)本专利技术所提供的一种TEMPO修饰的交联漆酶聚集体制备过程包括交联和与4
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氧自本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种TEMPO修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将漆酶分散于去离子水中，过滤去除不溶物，获得粗酶溶液；(2)在搅拌条件下，将粗酶溶液加入到沉淀剂中沉淀，搅拌，然后加入丙烯酸酯类交联剂溶液进行反应，反应结束后离心、洗涤，获得交联漆酶聚集体；(3)将交联漆酶聚集体分散于溶剂中，获得交联漆酶聚集体分散液；在搅拌条件下，向交联漆酶聚集体分散液中加入4
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氧自由基溶液进行迈克尔加成反应，反应结束后离心、洗涤，获得所述TEMPO修饰的交联漆酶聚集体。2.根据权利要求1所述的TEMPO修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，漆酶与去离子水的质量比为1:10～1:15。3.根据权利要求1所述的TEMPO修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，沉淀剂选自丙酮、异丙醇、乙腈中的一种，粗酶溶液与沉淀剂的体积比为1:3～1:6；搅拌条件为常温下搅拌1～10min。4.根据权利要求1所述的TEMPO修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，丙烯酸酯类交联剂为二丙二醇二丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、双三羟甲基丙烷四丙烯酸酯、聚二季戊四醇六丙烯酸酯化合物中的一种；丙烯酸酯类交联剂溶液是将丙烯酸酯类交联剂溶于溶剂中制备得到，所述丙烯酸酯类交联剂溶液浓度为20～100mmol/L；丙烯酸酯类交联剂溶液与粗酶溶液体积比为1:2～1:5；所述反应的条件为25～35℃水浴中恒温反应10～19h。5.根据权利要求1所述的TEMPO修饰的交联漆酶聚集体的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，4
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氧自由基溶液与交联漆酶聚集体分散液的体积比为1:3～1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈天有，彭燕，丘美爽，徐祖顺，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：