一种能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液及其应用制造技术

本发明专利技术属于细胞冻存复苏技术领域，具体涉及一种能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液及其应用，本发明专利技术通过穿膜肽将海藻糖转运至人多能干细胞胞内，提升胞内海藻糖浓度，其作为胞内冷冻保护剂用于人多能干细胞的冷冻保存。由于穿膜肽的作用，将很多能干细胞细胞膜不可透过的海藻糖在低胞外海藻糖条件下转运至细胞内，使其在胞内积累至高浓度，在低二甲基亚砜浓度下实现对人多能干细胞的冷冻保存。该方法具备生物相容性和人多能干细胞冷冻复苏好等优点。冷冻复苏好等优点。冷冻复苏好等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液及其应用


[0001]本专利技术属于细胞冻存复苏
，具体涉及一种能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液及其应用。

技术介绍

[0002]传统的细胞长期冷冻保存涉及缓慢冷冻程序。为了避免低温下冷冻解冻过程对细胞的破坏，细胞渗透冷冻保护剂(CPA)被广泛使用。由于DMSO和甘油等常用的渗透性冷冻保护剂可能对细胞具有毒性，因此每次对细胞解冻时需进行多次洗涤步骤。在此过程中可能会损伤部分细胞，因此，低DMSO的冷冻保存是降低细胞损伤、避免干细胞在冷冻复苏后的生物功能变化的有效途径之一。
[0003]海藻糖是一种无毒、非渗透性的CPA，可以应用于动物细胞的冷冻保存。海藻糖的细胞保护机制被比作像水一样起作用，与水形成氢键或者形成低迁移率的玻璃态，以限制细胞的代谢活动。目前海藻糖已被用于小鼠精子、成人造血细胞、红细胞、人体脂肪组织来源的间充质基质细胞和人类可移植肝细胞的冷冻保存。海藻糖作为稳定细胞的活性和功能的一种天然非膜渗透性保护剂，实现海藻糖的胞内递送是将其用于不同细胞的长期冷冻保存的前提。
[0004]目前海藻糖胞内递送涉及超声和显微注射的物理方法和纳米颗粒和脂质体的递送体系。脂质体具有稳定性和海藻糖负载不足等局限性；纳米颗粒体系涉及海藻糖的胞内释放问题；超声方法则会影响细胞形态破坏细胞膜，显微注射只是用于丹大细胞体系，而无法应用于大量细胞的海藻糖递送。
[0005]目前，未发现能够实现海藻糖在人多能干细胞的胞内递送及其在冷冻保存应用方面的相关报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服传统技术中存在的上述问题，提供一种能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液及其应用。
[0007]为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术是通过以下技术方案实现：
[0008]本专利技术提供一种能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液，该冻存液包括穿膜肽和海藻糖。
[0009]进一步地，如上所述能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液中，所述穿膜肽和海藻糖的摩尔比为1：4～32。
[0010]进一步地，如上所述能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液中，所述穿膜肽的浓度为0.05～4mM。
[0011]进一步地，如上所述能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液中，所述穿膜肽的浓度为0.1～2mM。
[0012]进一步地，如上所述能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液中，所述海藻糖的浓度为0.1～50mM。
[0013]进一步地，如上所述能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液中，所述海藻糖的浓度为1～30mM。
[0014]本专利技术还提供上述冻存液在冻存人多能干细胞中的应用或在制备人多能干细胞冻存产品中的应用。
[0015]进一步地，冻存液在冻存人多能干细胞中的应用中，能够显著提高在低浓度二甲基亚砜(DMSO)下细胞冷冻复苏。
[0016]进一步地，冻存液在冻存人多能干细胞中的应用中，能够显著提高胞内海藻糖多能干细胞在4％
‑
8％vol/vol低浓度二甲基亚砜下的细胞冷冻复苏率。
[0017]进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。
[0018]本专利技术还提供上述冻存液在如下任一中的应用：
[0019](1)在建立人多能干细胞库中的应用；
[0020](2)在复苏后用于研究的人多能干细胞冻存中的应用；
[0021](3)在复苏后用于生产的人多能干细胞冻存中的应用；
[0022](4)在复苏后用于质量控制和质量检测的人多能干细胞冻存中的应用；
[0023](5)在复苏后用于三胚层细胞分化和制备衍生功能细胞的人多能干细胞冻存中的应用。本领域中，人多能干细胞为可在体外无限制的自我更新，并且具有向三胚层细胞分化潜能的干细胞。人多能干细胞包括受精胚胎来源胚胎干细胞、孤雌胚胎来源胚胎干细胞、孤雄胚胎来源胚胎干细胞、核移植胚胎干细胞、诱导多能干细胞、naive状态人胚干细胞等。三胚层包括内胚层、中胚层和外胚层。所述三胚层细胞及衍生功能细胞包括但不限于：定型内胚层(definitive endoderm)细胞，及其衍生肝祖细胞、肝细胞、胆管细胞、胰岛细胞等；早期中胚层(early mesoderm)细胞，及其衍生间充质干细胞、造血干细胞、心肌细胞等；神经外胚层(neuroectoderm)细胞，及其衍生间神经干/前体细胞、神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等。
[0024]本专利技术还提供一种能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的方法，该方法采用穿膜肽携带海藻糖进入人多能干细胞。
[0025]本专利技术的有益效果是：
[0026]1、本专利技术提供的冻存液设计科学合理，其采用穿膜肽携带海藻糖，能够提高人多能干细胞内的海藻糖浓度。
[0027]2、本专利技术中，海藻糖胞内加载过程对细胞毒性低。
[0028]3、本专利技术中，胞内海藻糖可以提升低DMSO下冷冻复苏率。
[0029]当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上的所有优点。
附图说明
[0030]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0031]图1为穿膜肽
‑
海藻糖对hiPSC的细胞毒性示意图；
[0032]图2为海藻糖的细胞毒性示意图；
[0033]图3为海藻糖长时间孵育后的细胞毒性示意图；
[0034]图4为海藻糖孵育后胞内海藻糖浓度示意图；
[0035]图5为不同比例CPP
‑
海藻糖共育后细胞内海藻糖浓度示意图；
[0036]图6为低浓度海藻糖与hiPSC短时孵育后胞内海藻糖浓度示意图；
[0037]图7为5％ DMSO下冻存液复苏培养后细胞增殖率测定示意图；
[0038]图8为7.5％ DMSO下冻存液复苏培养后细胞增殖率测定示意图。
具体实施方式
[0039]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0040]本专利技术通过穿膜肽将海藻糖转运至人多能干细胞胞内，提升胞内海藻糖浓度，其作为胞内冷冻保护剂用于人多能干细胞的冷冻保存。由于穿膜肽的作用，将很多能干细胞细胞膜不可透过的海藻糖在低胞外海藻糖条件下转运至细胞内，使其在胞内积累至高浓度，在低二甲基亚砜浓度下实现对人多能干细胞的冷冻保存。该方法具备生物相容性和人多能干细胞冷冻复苏好等优点。
[0041]本专利技术的具体实施例如下：...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液，其特征在于，该冻存液包括穿膜肽和海藻糖。2.根据权利要求1所述的能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液，其特征在于，所述穿膜肽和海藻糖的摩尔比为1：4～32。3.根据权利要求1所述的能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液，其特征在于，所述穿膜肽的浓度为0.05～4mM。4.根据权利要求3所述的能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液，其特征在于，所述穿膜肽的浓度为0.1～2mM。5.根据权利要求1所述的能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液，其特征在于，所述海藻糖的浓度为0.1～50mM。6.根据权利要求5所述的能够提升人多能干细胞胞内海藻糖浓度的冻存液，其特征在于，所述海藻糖的浓度为1～30mM。7.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐霞，郭阿伟，张楷，杨刚刚，郝瑾，
申请(专利权)人：安徽工业大学，
类型：发明
国别省市：