纯化腺病毒的方法技术

披露了可以大规模进行的纯化腺病毒的方法。这些方法通过以下步骤从包含或源自宿主细胞群的含腺病毒的样品中纯化腺病毒：澄清样品，其中澄清包括深层过滤然后微滤；通过阴离子交换层析处理澄清的样品；和通过切向流过滤(TFF)处理阴离子交换产物以提供TFF产物。(TFF)处理阴离子交换产物以提供TFF产物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纯化腺病毒的方法


[0001]本专利技术涉及纯化腺病毒的方法。更具体地，本专利技术涉及纯化腺病毒的方法，其可以大规模地进行。

技术介绍

[0002]腺病毒是双链DNA病毒，其具有大约为26
‑
46kb的基因组。腺病毒具有物种特异性并且已从多种哺乳动物物种中分离出不同的血清型。人腺病毒无处不在，大多数人都已感染了一种或多种血清型，导致终身免疫。
[0003]修饰的腺病毒可用作载体来递送编码外源抗原的DNA。复制缺陷型腺病毒载体已广泛用于疫苗，因为它们会诱导对由载体编码的异源基因的强烈的体液和T细胞应答。
[0004]腺病毒载体的生产工艺包括用腺病毒感染宿主细胞并培养该宿主细胞以提高病毒滴度。然后在下游纯化处理之前裂解细胞以除去杂质(包括细胞和细胞碎片)。
[0005]目前用于纯化腺病毒的方法不经济且缺乏可扩大性(scalability)。因此，需要开发用于纯化宿主细胞培养系统内产生的腺病毒的大规模工艺。

技术实现思路

[0006]本专利技术至少部分地涉及开发改进的腺病毒纯化方法，这些方法可有效地从宿主细胞培养物中纯化腺病毒并且与替代的纯化方法相比具有减少的处理时间。与替代的纯化方法相比，本专利技术的这些纯化方法还可以降低对某些可能供应不足的原材料的依赖性。因此，本专利技术的方法在需要大量腺病毒载体的情况(例如用于为流行病和大流行病提供基于腺病毒的疫苗)下具有特别的用途。
[0007]因此，在一方面，提供了一种从含腺病毒的样品中纯化腺病毒的方法，该样品包含或源自具有至少约4x106个细胞/mL的细胞密度的宿主细胞群，该方法包括：
[0008](a)澄清该样品以提供澄清的样品，其中澄清包括深层过滤然后微滤；
[0009](b)通过阴离子交换层析处理澄清的样品以提供阴离子交换产物；以及
[0010]通过切向流过滤(TFF)处理该阴离子交换产物以提供TFF产物，其中TFF包括超滤和渗滤。
[0011]在另一方面，提供了纯化腺病毒的方法，如图2所述。
[0012]在又另一方面中，提供了纯化腺病毒的方法，如实例2所述。
[0013]在又另一方面中，提供了一种纯化的腺病毒，其是通过本专利技术的方法可获得的或通过本专利技术的方法获得的。
[0014]在又另一方面中，提供了原料药，其是通过本专利技术的方法可获得的或通过本专利技术的方法获得的。
[0015]在所附权利要求中陈述了本专利技术的多个方面和实施例。本文还描述了本专利技术的这些和其他的方面和实施例。
附图说明
[0016]图1示出了示例性腺病毒纯化工艺，其包括生物反应器产物的细胞裂解和核酸酶消化、澄清、第一切向流过滤、阴离子交换层析、第二切向流过滤和无菌过滤的步骤。
[0017]图2示出了根据本专利技术所述的示例性腺病毒纯化工艺，其包括起始材料的细胞裂解和核酸酶消化、澄清、阴离子交换层析、切向流过滤、配制和无菌过滤的步骤。
[0018]图3示出了根据本专利技术所述的示例性腺病毒纯化工艺的变化形式，其包括混合模式尺寸排阻层析的另外步骤。
[0019]序列表说明
[0020][0021][0022]具体实施方式
[0023]含腺病毒的样品
[0024]本专利技术的方法能够从含腺病毒的样品中大规模纯化腺病毒。例如，本专利技术的方法能够处理多达约5000升，例如从约3升至约3000升，优选地约200升直至约2000升的范围的体积。
[0025]含腺病毒的样品可以含有至少一种宿主细胞蛋白(HCP)。如本文所用，术语“HCP”是指由宿主细胞群产生或编码的蛋白质。
[0026]含腺病毒的样品可以具有至少约20,000ng/mL、至少约30,000ng/mL、至少约40,000ng/mL、至少约50,000ng/mL、至少约60,000ng/mL、至少约70,000ng/mL、至少约80,000ng/mL、至少约90,000ng/mL或至少约100,000ng/mL的HCP浓度。在优选的实施例中，该含腺病毒的样品具有至少约50,000ng/mL的HCP浓度。
[0027]含腺病毒的样品可以具有多达约100,000ng/mL、多达约90,000ng/mL、多达约80,000ng/mL、多达约70,000ng/mL、多达约60,000ng/mL、多达约50,000ng/mL、多达约40,000ng/mL、多达约30,000ng/mL、或多达约20,000ng/mL的HCP浓度。
[0028]含腺病毒的样品可以具有约20,000ng/mL和约100,000ng/mL之间、约30,000ng/mL和约90,000ng/mL之间或约50,000ng/mL和约80,000ng/mL之间的HCP浓度。
[0029]可适于宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)的大规模细胞培养的本领域已知的任何上游病毒生产工艺可用于产生用于本专利技术的方法的起始材料。
[0030]在优选的实施例中，含腺病毒的样品包含宿主细胞群或由宿主细胞群组成。宿主细胞群可以在细胞培养容器中培养。如本文所用，“细胞培养容器”是指适合用于培养细胞的容器。优选地，细胞培养容器是生物反应器。如本文所用，“生物反应器”意指适于大规模工艺的细胞培养容器。例如，在一些实施例中，生物反应器具有至少约1L、优选至少约1.2L、约3L、约50L、约1000L、约2000L、约3000L、或约5000L、最优选至少约2000L的容量。在一些实施例中，生物反应器具有至少约7x109个活T
‑
REx
TM
细胞、优选至少约2.1x10
10
个活T
‑
REx
TM
细胞、至少约3.5x10
11
个活T
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REx
TM
细胞、至少约5x10
12
个活T
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REx
TM
细胞或至少约3x10
13
个活T
‑
REx
TM
细胞、最优选至少约5x10
12
个活T
‑
REx
TM
细胞的容量。
[0031]在收获时，宿主细胞群可以具有至少约5x106个细胞/mL、至少约6x106个细胞/mL、至少约7x106个细胞/mL、至少约8x106个细胞/mL、至少约9x106个细胞/mL或至少约1x107个细胞/mL的细胞密度(例如活细胞密度)。在优选的实施例中，在收获时，宿主细胞群具有至少约4x106个细胞/mL的细胞密度(例如活细胞密度)。
[0032]在收获时，宿主细胞群可以具有高达约1x109个细胞/mL、高达约1x108个细胞/mL、高达约8x107个细胞/mL、高达约6x107个细胞/mL、高达约4x107个细胞/mL、高达约2x107个细胞/mL、高达约1x107个细胞/mL、高达约8x106个细胞/mL或高达约6x106个细胞/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从含腺病毒的样品中纯化腺病毒的方法，该样品包含或源自具有至少约4x106个细胞/mL的细胞密度的宿主细胞群，该方法包括：(a)澄清该样品以提供澄清的样品，其中澄清包括深层过滤然后微滤；(b)通过阴离子交换层析处理该澄清的样品以提供阴离子交换产物；以及(c)通过切向流过滤(TFF)处理该阴离子交换产物以提供TFF产物，其中TFF包括超滤和渗滤。2.如权利要求1所述的方法，其中该阴离子交换产物在进一步的步骤中通过混合模式尺寸排阻层析处理以提供混合模式尺寸排阻产物，并且其中该混合模式排阻产物通过步骤(c)的TFF进行处理。3.如权利要求1或2所述的方法，其中该含腺病毒的样品包含宿主细胞群。4.如权利要求2所述的方法，其中该宿主细胞群具有至少约6x106个细胞/mL、至少约8x106个细胞/mL或至少约1x107个细胞/mL的细胞密度。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中该方法包括在步骤(a)之前裂解该宿主细胞群以提供细胞裂解物。6.如权利要求5所述的方法，其中该方法包括用细胞裂解剂裂解该宿主细胞群。7.如权利要求6所述的方法，其中该裂解剂包含非离子洗涤剂，任选地其中该非离子洗涤剂是聚山梨醇酯
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20。8.如权利要求5
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7中任一项所述的方法，其中该细胞裂解物包含浓度为至少约50,000ng/mL的宿主细胞蛋白。9.如权利要求6
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8中任一项所述的方法，其中该方法包括在步骤(a)之前或在步骤(a)期间，用核酸酶处理该细胞裂解物。10.如权利要求9所述的方法，其中该核酸酶是DNA酶和/或RNA酶。11.如权利要求9或10所述的方法，其中该核酸酶是12.如权利要求1或2所述的方法，其中该含腺病毒的样品包含细胞裂解物。13.如权利要求12所述的方法，其中该细胞裂解物是通过向具有至少约6x106个细胞/mL、至少约8x106个细胞/mL或至少约1x107个细胞/mL的细胞密度的宿主细胞群中添加细胞裂解剂来获得的。14.如权利要求13所述的方法，其中该细胞裂解剂包含非离子洗涤剂，任选地其中该非离子洗涤剂是聚山梨醇酯
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20。15.如权利要求12
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14中任一项所述的方法，其中该细胞裂解物包含浓度为至少约50,000ng/mL的宿主细胞蛋白。16.如权利要求12
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15中任一项所述的方法，其中该细胞裂解物已用核酸酶处理。17.如权利要求16所述的方法，其中该核酸酶是DNA酶和/或RNA酶。18.如权利要求9或10所述的方法，其中该核酸酶是19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的深层过滤包括使用单一类型的深层过滤器。20.如权利要求19所述的方法，其中该深层过滤器具有约0.2μm和约2μm之间的标准过滤规格，任选地其中该深层过滤器是HC Pro Pod深层过滤器、C0SP介质。
21.如权利要求1
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18中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的该深层过滤包括使用串联的至少两个不同的深层过滤器。22.如权利要求21所述的方法，其中步骤(a)中的该深层过滤包括使用具有标准过滤规格为约0.2μm和约2μm之间的深层过滤器和具有标准过滤规格为大于0μm和最多约0.1μm的深层过滤器。23.如权利要求21或22所述的方法，其中该至少两个不同的深层过滤器选自：HC Pro Pod深层过滤器、C0SP介质；Pod深层过滤器、X0HC介质；和HC Pro Pod深层过滤器、X0SP介质。24.如权利要求21
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23中任一项所述的方法，其中该至少两个不同的深层过滤器是：HC Pro Pod深层过滤器、C0SP介质和HC Pro Pod深层过滤器、X0SP介质；或HC Pro Pod C0SP过滤器和Pod X0HC过滤器。25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该微滤膜具有约0.2μm的膜孔径。26.如权利要求24或25所述的方法，其中该微滤膜是密理博公司SHC 0.5/0.2μm过滤膜。27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的该阴离子交换层析包括将该澄清的样品应用于阴离子交换膜。28.如权利要求27所述的方法，其中该阴离子交换膜包含二乙氨基乙基(DEAE)、季氨乙基(QAE)或季铵(Q)取代基。29.如权利要求28所述的方法，其中该阴离子交换膜包含季铵(Q)取代基。30.如权利要求27
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29中任一项所述的方法，其中该阴离子交换膜具有至少约3μm的标准孔径。31.如权利要求27
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30中任一项所述的方法，其中该阴离子交换膜是Q膜。32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(b)包括在阴离子交换层析之前，通过微滤处理该澄清的样品。33.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：T，
申请(专利权)人：阿斯利康英国有限公司，
类型：发明
国别省市：