肉及肉制品中L-羟脯氨酸的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种肉及肉制品中L

【技术实现步骤摘要】
肉及肉制品中L
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羟脯氨酸的检测方法


[0001]本专利技术属于食品检测领域，尤其涉及肉及肉制品中游离态L
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羟脯氨酸的检测方法。

技术介绍

[0002]羟脯氨酸是胶原蛋白的一种特征氨基酸，胶原蛋白又是结缔组织的主要成分。羟脯氨酸的存在促进了胶原蛋白的形成，进而影响了肉的质地和感官特性。因此，评估肉及肉制品中羟脯氨酸的含量是评估其质量的一种简单而实用的方法。
[0003]由于羟脯氨酸通常以蛋白质的形式存在于样品中，因此要将羟脯氨酸解离为游离态后再进行测定。目前，常用的肉及肉制品中蛋白质水解方法包括酸水解法、微波水解蛋白法以及酶解法。羟脯氨酸的检测方法包括比色法、氨基酸分析法、毛细管胶束电动色谱法、高光谱成像法、结缔组织胶原蛋白的自身荧光法、核磁共振碳谱、核磁共振成像法、柱前衍生高效液相色谱法、柱后衍生高效液相色谱法、高效液相色谱串联质谱法以及高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测法。
[0004]目前测定肉及肉制品中羟脯氨酸最广泛的方法是酸水解
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比色法。虽然这种方法能够检测猪肉中羟脯氨酸的含量，但是这种方法实验过程繁琐、氧化程度及反应颜色难以控制、耗时长。利用酶解蛋白质中酶的反应条件苛刻、特异性强，成本高且难于保存。彭碧宁等人利用氨基酸分析仪对酱油中羟脯氨酸的含量进行了测定，此法自动化程度好，重现性和准确度较好，然而需要专业的氨基酸分析仪和较多缓冲液。同样，毛细管胶束电动色谱自动化程度高、灵敏度高、工作时间短，能有效测定乳制品中羟脯氨酸的含量，然而其费用较高，尚未有较大普及范围，比较局限于精密检测研究的实验室，普通实验室难以实现。利用高光谱成像技术检测羟脯氨酸在1991年被提出，虽然在样品前处理上简单环保，但数据量大且需要专业的计算机编程来完成，数据分析时间较长，故至今仍未大范围使用。核磁共振碳谱法适用范围小，对纯度80％以上的单体化合物才能进行较准确检测。高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测器在2008年即被提出，然而仪器费用高，适用范围不够宽，普及范围有限，亦未成为羟脯氨酸检测的主流方法。因此，寻求一种快速、准确、简单的羟脯氨酸检测方法是肉制品行业亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，并提供一种快速、准确、适用范围广的肉及肉制品中L
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羟脯氨酸的检测方法。
[0006]由于羟脯氨酸没有紫外或荧光响应，为提高分析检测灵敏度和分离选择性，将羟脯氨酸衍生化，接上发光或发色基团，形成具有紫外相应的衍生物，再进行定性定量分析。随着衍生氨基酸技术不断完善，近年来，PITC法已成为普遍用于RP
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HPLC分析氨基酸方法之一。羟脯氨酸可与异硫氰酸苯酯(PITC)反应生成能用紫外检测的PTC
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羟脯氨酸。
[0007]本专利技术所采用的具体技术方案如下：
[0008]本专利技术提供了一种肉及肉制品中L
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羟脯氨酸的检测方法，具体如下：
[0009]S1，制备待测样品：将样品使用微波消解仪进行消解，以破坏样品内脂肪和蛋白质并释放出游离氨基酸，得到待测样品；利用L
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羟脯氨酸标准品得到不同浓度的标准系列溶液；
[0010]S2，衍生：将所述标准系列溶液和所述待测样品分别与异硫氰酸苯酯(PITC)进行衍生，以生成能用紫外检测到的PTC
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羟脯氨酸；
[0011]S3，分离检测：采用高效液相色谱
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紫外检测方法，分离检测步骤S2中标准系列溶液和待测样品衍生后生成的L
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羟脯氨酸，得到待测样品的色谱图和标准系列溶液的色谱图并将两者进行比较，使用外标法对样品中L
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羟脯氨酸含量进行测定。
[0012]作为优选，所述步骤S1中消解过程具体如下：
[0013]称取制样均匀的样品0.8～1g置于50mL消解管中，向所述消解管中加入质量浓度为5％～50％的盐酸10mL，随后将所述消解管放入微波消解仪中；微波消解仪的消解温度为110～140℃，消解时间为20～60min。
[0014]进一步的，盐酸浓度较佳地为50％，消解温度较佳地为130℃，消解时间较佳地为60min。
[0015]作为优选，所述步骤S1中，标准系列溶液是将L
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羟脯氨酸标准品溶于水所得的浓度在1
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1000mg/L之间的至少五组不同浓度的子溶液。
[0016]作为优选，所述步骤S2具体如下：
[0017]取所述待测样品200μL上清液至刻度试管中并用氮气吹干，向试管中加入200μL 0.1mol/L盐酸进行涡旋溶解，得到预备待测液；随后向所述标准系列溶液和所述预备待测液的各试管中加入含0.1mol/L异硫氰酸苯酯的乙腈溶液100μL以及含1mol/L三乙胺的乙腈溶液100μL，涡旋混合后并于10～40℃水浴衍生10～60min，接着向各试管中加入质量分数为50％的乙腈溶液并定容至1mL，过0.22μm滤膜备用。
[0018]进一步的，衍生温度较佳地为30℃，衍生时间较佳地为30min。
[0019]作为优选，所述步骤S3中高效液相色谱的条件如下：
[0020]流动相A：钠离子浓度为0.1moL/L的乙酸钠缓冲液，利用冰乙酸调节pH至6.3～6.7；流动相B：甲醇；所述流动相A与所述流动相B按照下述体积比进行梯度洗脱：第0min时加入95％的流动相A和5％的流动相B，第8min时加入95％的流动相A和5％的流动相B，第20min时加入20％的流动相A和80％的流动相B，第26min时加入95％的流动相A和5％的流动相B；洗脱时的流速为1.0mL/min。
[0021]作为优选，所述步骤S3中紫外检测器的检测波长为210～270nm。
[0022]进一步的，检测波长较佳地为254nm。由于羟脯氨酸没有紫外或荧光响应，为提高分析检测灵敏度和分离选择性，将羟脯氨酸衍生化，接上发光或发色基团，形成具有紫外相应的衍生物PTC
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羟脯氨酸，再进行定性定量分析。
[0023]作为优选，所述步骤S3中高效液相色谱的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱和保护柱；所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的规格为3μm、150mm
×
4.6mm，所述保护柱的规格为3μm、12.5mm
×
4.6mm。
[0024]作为优选，所述步骤S3中高效液相色谱的色谱柱的柱温为20～40℃，进样量为10～50μL。
[0025]进一步的，色谱柱的柱温较佳地为35℃，进样量较佳地为20μL。
[0026]作为优选，所述步骤S3具体如下：
[0027]将标准系列溶液中不同浓度的子溶液分别注入液相色谱仪中，测定相应的峰面积；随后以标准系列溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；接着将待测样品注入液相色谱仪中，得到峰面积，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肉及肉制品中L
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羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，具体如下：S1：将样品使用微波消解仪进行消解，以破坏样品内脂肪和蛋白质并释放出游离氨基酸，得到待测样品；利用L
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羟脯氨酸标准品得到不同浓度的标准系列溶液；S2：将所述标准系列溶液和所述待测样品分别与异硫氰酸苯酯进行衍生，以生成能用紫外检测到的PTC
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羟脯氨酸；S3：采用高效液相色谱
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紫外检测方法，分离检测步骤S2中标准系列溶液和待测样品衍生后生成的L
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羟脯氨酸，得到待测样品的色谱图和标准系列溶液的色谱图并将两者进行比较，使用外标法对样品中L
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羟脯氨酸含量进行测定。2.根据权利要求1所述的肉及肉制品中L
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羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中消解过程具体如下：称取制样均匀的样品0.8～1g置于50mL消解管中，向所述消解管中加入质量浓度为5％～50％的盐酸10mL，随后将所述消解管放入微波消解仪中；微波消解仪的消解温度为110～140℃，消解时间为20～60min。3.根据权利要求1所述的肉及肉制品中L
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羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，标准系列溶液是将L
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羟脯氨酸标准品溶于水所得的浓度在1
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1000mg/L之间的至少五组不同浓度的子溶液。4.根据权利要求1所述的肉及肉制品中L
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羟脯氨酸的检测方法，其特征在于，所述步骤S2具体如下：取所述待测样品200μL上清液至刻度试管中并用氮气吹干，向试管中加入200μL 0.1mol/L盐酸进行涡旋溶解，得到预备待测液；随后向所述标准系列溶液和所述预备待测液的各试管中加入含0.1mol/L异硫氰酸苯酯的乙腈溶液100μL以及含1mol/L三乙胺的乙腈溶液100μL，涡旋混合后并于10～40℃水浴衍生1...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱帅，郑仕剑，余荣璐，张水锋，盛华栋，
申请(专利权)人：浙江方圆检测集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：