miR-252b及其靶标基因SSE1在制备白蚁免疫抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了miR

【技术实现步骤摘要】
miR
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252b及其靶标基因SSE1在制备白蚁免疫抑制剂及其应用


[0001]本专利技术涉及绿色生物防治
，具体涉及白蚁体内miR
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252b及其靶标基因SSE1在制备白蚁免疫抑制剂，提高白蚁生物防治效果中的应用。

技术介绍

[0002]白蚁作为一种全球性的害虫，广泛分布于世界各地。其危害范围很广，能够对房屋建筑、水库堤坝、农业作物以及山林果树等造成严重危害。杀虫剂是一种见效快，使用方便且不受地域季节限制的化学农药，因而长年以来被人们广泛使用。但是由于其长期使用，一些白蚁已经产生了抗药性，需要使用更多的农药进行防治。而许多种化学农药会严重污染农产品、大气、水质和土壤，并会对有益生物造成危害，同时可以通过食物链进入人体，危害人群健康。因此迫切需要开发出可替代、生态友好和可持续的新型农药。
[0003]昆虫病原真菌如绿僵菌（Metarhizium）、白僵菌（Beauveria）和拟青霉（Paecilomyces）可以有效克服杀虫剂抗性，无污染，且与人体无害，是一种很有前景的害虫生物防治制剂。这些生防菌可以产生大量的孢子或分生孢子，这些孢子散布在昆虫周围，通过附着、萌发、芽管延伸、菌丝侵入这四个阶段感染宿主。分生孢子首先被动地附着与体壁，并在适宜的条件下开始萌发，通过菌丝尖端的机械压力并分泌几丁质酶来破坏体壁，进入宿主体腔。侵入血腔的菌丝转化为单细胞芽生孢子，利用昆虫体内的营养快速繁殖，并分泌毒素抑制昆虫免疫以便促进侵染，进而导致昆虫死亡。宿主死亡后菌丝就会沿着虫体的气门间隙和各环节间膜穿透体壁向外生长，产生新的分生孢子，开始新一轮的感染。然而作为社会性昆虫的白蚁，其独特的社会免疫体系可以在个体与群体水平上有效的抵抗病原真菌的侵染。这将阻碍生防菌最大限度的发挥效果。为了克服这一困难，需要开发出以害虫免疫系统为靶标的免疫抑制剂，从而降低害虫的免疫力，使其更易受病原物的侵染或是提高其杀虫剂易感性。
[0004]microRNA是一种在生物体内高度保守的，由20～30个核苷酸组成的小分子非编码RNA，能够引发的基因沉默现象。RNAi制剂本身是一种一段单链或双链的RNA分子，可通过多种方式进入昆虫体内，从而可以实现免疫相关基因的沉默，达到降低昆虫免疫力的效果。如今，RNAi广泛应用于多种昆虫基因功能研究中，如鳞翅目、蜚蠊目、同翅目和半翅目等，可以用于防治多种目的农业害虫。本专利技术拟以白蚁的miR
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252b及其靶标基因SSE1来制备免疫抑制剂，以便降低白蚁抵抗病原菌侵染能力，增强其对生防菌的易感性，从而提高防治效果。因此，本专利技术基于miR
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252b序列设计合成miR
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252b模拟物（一种双链小RNA），发现白蚁取食该模拟物后免疫相关基因被显著抑制，被绿僵菌感染后死亡率也显著上升。此外，本专利技术基于免疫基因SSE1序列设计合成SSE1dsRNA，利用RNase III将SSE1dsRNA消化成效果更强的SSE1siRNA，发现白蚁取食SSE1siRNA后，免疫相关基因SSE1被显著沉默，其免疫力显著下降，更易被绿僵菌侵染致死。因而，基于miR
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252b及其靶标基因SSE1制备的免疫抑制剂可以有效提高白蚁生防效果。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供miR
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252b及其靶标基因SSE1的序列，和miR
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252b模拟物以及SSE1siRNA在抑制白蚁免疫力，促进生防菌杀灭白蚁效果中的应用。
[0006]两种用于制备白蚁免疫抑制剂的DNA序列，即miR
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252b及其靶标基因SSE1，其特征在于，DNA序列来源于黑胸散白蚁全转录组数据库，miR
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252b的DNA序列为SEQ ID NO:1，SSE1的DNA序列为SEQ ID NO: 2。
[0007]一种制备miR
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252b模拟物的方法，步骤如下：（1）根据miR
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252b序列SEQ ID NO: 1设计成4条单链DNA，4条单链DNA分别为：正义链1为SEQ ID NO: 3，正义链2为SEQ ID NO: 4，反义链1为SEQ ID NO: 5和反义链2为SEQ ID NO: 6；（2）正义链1与正义链2等量混合后，进行退火PCR得到miR
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252b正义链DNA模板；反义链1与反义链2等量混合后，进行退火PCR得到miR
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252b反义链DNA模板；（3）将miR
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252b正义链DNA模板与反义链DNA模板等量混合，通过T7体外转录系统获得miR
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252b模拟物。
[0008]一种制备SSE1siRNA的方法，步骤如下：（1）根据SSE1序列SEQ ID NO: 2设计2条扩增引物，分别为上游引物为SEQ ID NO: 7和下游引物为SEQ ID NO: 8，通过PCR扩增获得SSE1基因片段，片段序列为SEQ ID NO:9；（2）根据SSE1基因片段SEQ ID NO: 9设计含转录增强子和T7启动子的特异性引物，上游引物为SEQ ID NO: 10，下游引物为SEQ ID NO: 11，通过PCR扩增获得SSE1dsRNA模板，序列为SEQ ID NO: 12；（3）利用SSE1dsRNA模板SEQ ID NO: 12，通过T7体外转录系统获得SSE1dsRNA，随后利用RNase III将SSE1dsRNA消化成作用效果更强的SSE1siRNA。
[0009]一种含miR
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252b模拟物或者SSE1siRNA的白蚁免疫抑制剂产品。
[0010]一种抑制白蚁免疫力的方法，将miR
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252b模拟物或者SSE1siRNA的白蚁免疫抑制剂与白蚁食物、饵剂混合，放入白蚁群体中供白蚁取食，实现抑制白蚁免疫力；食物、饵剂为纸片、木块、木屑、木粉或者含纤维素为主要成分的制品；混合方式为浸润、涂抹、或注入。
[0011]miR
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252b模拟物或者SSE1siRNA免疫抑制剂作为活性成分的白蚁生物防治产品。
[0012]miR
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252b模拟物或者SSE1siRNA免疫抑制剂协同生防真菌制备得到的防治白蚁的产品，所述的生防真菌包括如绿僵菌、白僵菌或拟青霉之类的具有杀虫功能的虫生真菌。
[0013]一种白蚁的生物防治方法，通过喂食miR
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252b模拟物或者SSE1siRNA免疫抑制剂抑制白蚁免疫力，随后利用孢子悬浮液感染白蚁，感染方式包括注射、点滴、涂抹、喷洒。
[0014]一种制备孢子悬浮液的方法，步骤如下：（1）向水中加入表面活性剂如吐温、曲拉通以及其他能够降低物品表面张力的产品，浓度为0.01
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5%；（2）利用小勺、小刀以及其他能够进行刮取操作的工具刮取固体培养基表面的真菌分生孢子或者利用离本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.两种用于制备白蚁免疫抑制剂的DNA序列，即miR
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252b及其靶标基因SSE1，其特征在于，DNA序列来源于黑胸散白蚁全转录组数据库，miR
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252b的DNA序列为SEQ ID NO:1，靶标基因SSE1的DNA序列为SEQ ID NO:2。2.根据权利要求1所述的miR
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252b的DNA序列制备miR
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252b模拟物，其特征在于，包括如下步骤：（1）根据miR
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252b序列SEQ ID NO:1设计成4条单链DNA，4条单链DNA分别为：正义链1为SEQ ID NO: 3，正义链2为SEQ ID NO: 4，反义链1为SEQ ID NO:5和反义链2为SEQ ID NO:6；（2）正义链1与正义链2等量混合后，进行退火PCR得到miR
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252b正义链DNA模板；反义链1与反义链2等量混合后，进行退火PCR得到miR
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252b反义链DNA模板；（3）将miR
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252b正义链DNA模板与反义链DNA模板等量混合，通过T7体外转录系统获得miR
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252b模拟物。3.根据权利要求1所述的SSE1序列SEQ ID NO:2制备SSE1 siRNA，其特征在于，包括如下步骤：（1）根据SSE1序列SEQ ID NO:2设计2条扩增引物，分别为上游引物为SEQ ID NO:7和下游引物为SEQ ID NO:8，通过PCR扩增获得SSE1基因片段，片段序列为SEQ ID NO: 9；（2）根据SSE1基因片段SEQ ID NO:9设计含转录增强子和T7启动子的特异性引物，上游引物为SEQ ID NO:10，下游引物为S...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤清波，刘龙，冯怡颖，杨淑芳，张元臣，黄求应，孙龙龙，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：