通过自动化迭代LC-MS/MS(HCP-AIMS)对宿主细胞蛋白杂质进行无偏和高通量鉴定和定量以进行治疗蛋白开发制造技术

本公开总体上涉及在治疗蛋白开发中鉴定和定量宿主细胞蛋白(HCP)的方法。具体地，本发明专利技术总体上涉及用于在治疗蛋白开发中对HCP进行无偏鉴定和灵敏定量的液相色谱

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过自动化迭代LC
‑
MS/MS(HCP
‑
AIMS)对宿主细胞蛋白杂质进行无偏和高通量鉴定和定量以进行治疗蛋白开发
[0001]相关申请交叉引用
[0002]本申请要求于2020年11月17日提交的美国临时专利申请第63/114,746号的优先权和权益，所述美国临时专利申请通过引用并入本文。


[0003]本专利技术总体上涉及在治疗蛋白开发中鉴定和定量宿主细胞蛋白(HCP)的方法。具体地，本专利技术总体上涉及用于在治疗蛋白开发中鉴定和灵敏定量HCP的液相色谱
‑
串联质谱(LC
‑
MS/MS)方法。

技术介绍

[0004]残余的宿主细胞蛋白(HCP)的存在可能会引起生物制药产品的潜在安全风险和制造中的问题。由于重组DNA技术已经广泛用于在宿主细胞中产生生物制药产品，因此有必要去除杂质以获得具有高纯度的生物制药产品。在进行临床研究之前，进行纯化生物处理之后的任何残余杂质应以可接受的低水平存在。具体地，源自哺乳动物表达系统，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的残余HCP可能危及产品安全性、质量和稳定性。即使痕量的特定HCP有时也可能引起免疫原性应答或不令人期望的修饰。因此，需要监测药物产品中以及制造工艺期间的宿主细胞蛋白。
[0005]液相色谱
‑
串联质谱(LC
‑
MS/MS)已经成为在工艺开发和分析表征中监测HCP杂质的有力方法。然而，由于样品制备和LC
‑
MS/MS方法的复杂性的差异，在可以提供快速且无偏的HCP鉴定的基于质谱的方法与深度和灵敏的蛋白质鉴定或准确的蛋白质定量之间通常存在权衡。
[0006]应当理解，需要以稳健且无偏的方式鉴定和定量药物产品中的HCP以减轻安全风险和优化质量的方法。

技术实现思路

[0007]限定HCP杂质的可接受的水平已经成为使用生物处理系统制造生物制药产品的关键问题。需要鉴定和表征残余的HCP杂质，以优化治疗蛋白产品的安全性和质量。本申请提供了用于对HCP杂质进行稳健地鉴定和定量的方法。
[0008]本公开提供了一种用于在具有至少一种宿主细胞蛋白(HCP)和至少另一种蛋白质的样品中鉴定所述至少一种HCP的方法，所述方法包括：在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)使所述样品经受色谱柱，以获得色谱洗脱峰；(b)通过进行跨所述色谱洗脱峰的数据依赖性采集循环来进行串联质谱分析，其中所述循环包含：(i)获得质谱扫描；(ii)从所获取的质谱扫描中选择多个前体离子作为自动排除集；以及(iii)在排除所述自动排除集中的所述多个前体离子集之后获得第二质谱扫描；以及(c)在所述采集循环运行预定次数之后，使用所述所获得的质谱扫描来鉴定所述至少一种HCP。
[0009]在一方面，所述预定数量的循环是一个、两个、三个、四个或更多个循环。在另一方面，用于选择用于自动排除集的前体离子的质量误差容限为约15ppm。在另一方面，用于选择用于自动排除集的前体离子的保留时间容限为约
‑
0.2分钟至约+0.4分钟。在另一方面，所述自动排除集还包含至少一个本底离子。在又另一方面，所述自动排除集包含不是来自所获取的质谱扫描的至少一个另外的前体离子。在又另一方面，如果来自所获取的质谱的前体离子落在预定强度阈值以下，那么不将所述前体离子添加到所述自动排除集中。
[0010]在一方面，所述样品是使用直接消化制备的。在另一方面，所述样品是使用天然消化制备的。在另一方面，所述样品是使用免疫沉淀制备的。在又另一方面，所述样品是使用基于活性的蛋白质谱分析(activity
‑
based protein profiling)制备的。在另一方面，所述样品是使用分级分离制备的。在另一方面，所述样品是使用过滤制备的。
[0011]在一方面，色谱柱包括反相液相柱、离子交换柱、尺寸排阻柱、亲和柱、疏水相互作用柱、亲水相互作用柱、混合模式柱或其组合。
[0012]在一方面，所述样品包括所关注蛋白质。在一具体方面，所述所关注蛋白质的浓度是至少一种所鉴定的HCP的浓度的至少1000倍、至少10,000倍、至少100,000倍或至少1,000,000倍。在又另一具体方面，所述所关注蛋白质是抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体
‑
药物缀合物、融合蛋白或药物。
[0013]在一方面，质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪，其中所述质谱仪耦接到液相色谱系统。在一具体方面，LC
‑
MS/MS系统与高场非对称波形离子迁移率谱(FAIMS)耦接。
[0014]本公开还提供了一种用于在具有至少一种宿主细胞蛋白(HCP)和至少另一种蛋白质的样品中定量所述至少一种HCP的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)使所述样品经受色谱柱，以获得色谱洗脱峰；(b)通过进行跨所述色谱洗脱峰的数据依赖性采集循环来进行串联质谱分析，其中所述循环包含：(i)获得质谱扫描；(ii)从所获取的质谱扫描中选择多个前体离子作为自动排除集；以及(iii)在排除所述自动排除集中的所述多个前体离子集之后获得第二质谱扫描；以及(c)在所述采集循环运行预定次数之后，使用所述所获得的质谱扫描来定量所述至少一种HCP。
[0015]在一方面，所述预定数量的循环是一个、两个、三个、四个或更多个循环。在另一方面，用于选择用于自动排除集的前体离子的质量误差容限为约15ppm。在另一方面，用于选择用于自动排除集的前体离子的保留时间容限为约
‑
0.2分钟至约+0.4分钟。在另一方面，所述自动排除集还包含至少一个本底离子。在又另一方面，所述自动排除集包含不是来自所获取的质谱扫描的至少一个另外的前体离子。在又另一方面，如果来自所获取的质谱的前体离子落在预定强度阈值以下，那么不将所述前体离子添加到所述自动排除集中。
[0016]在一方面，所述样品是使用直接消化制备的。在另一方面，所述样品是使用天然消化制备的。在另一方面，所述样品是使用免疫沉淀制备的。在又另一方面，所述样品是使用基于活性的蛋白质谱分析制备的。在另一方面，所述样品是使用分级分离制备的。在另一方面，所述样品是使用过滤制备的。
[0017]在一方面，色谱柱包括反相液相柱、离子交换柱、尺寸排阻柱、亲和柱、疏水相互作用柱、亲水相互作用柱、混合模式柱或其组合。
[0018]在一方面，所述样品包括所关注蛋白质。在一具体方面，所述所关注蛋白质的浓度
是至少一种所定量的HCP的浓度的至少1000倍、至少10,000倍、至少100,000倍或至少1,000,000倍。在又另一具体方面，所述所关注蛋白质是抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体
‑
药物缀合物、融合蛋白或药物。
[0019]在一方面，质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪，其中所述质谱仪耦接到液相色谱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在具有至少一种宿主细胞蛋白(HCP)和至少另一种蛋白质的样品中鉴定所述至少一种HCP的方法，所述方法包括：(a)使所述样品经受色谱柱，以获得色谱洗脱峰；(b)进行串联质谱分析，所述串联质谱分析包含跨(a)的所述色谱洗脱峰的数据依赖性采集循环，其中所述数据依赖性采集循环包含：(i)获得质谱扫描；(ii)从所获得的质谱扫描中选择多个前体离子作为自动排除集；以及(iii)在排除所述自动排除集中的所述多个前体离子集之后获得第二质谱扫描；以及(c)在所述采集循环运行预定次数之后，使用所述所获得的质谱扫描来鉴定所述至少一种HCP。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述预定数量的循环是一个、两个、三个、四个或更多个循环。3.根据权利要求1所述的方法，其中用于选择用于自动排除集的前体离子的质量误差容限为约15ppm。4.根据权利要求1所述的方法，其中用于选择用于自动排除集的前体离子的保留时间容限为约
‑
0.2分钟至约+0.4分钟。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述自动排除集还包含至少一个本底离子。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述自动排除集包含不是来自所获取的质谱扫描的至少一个另外的前体离子。7.根据权利要求1所述的方法，其中如果来自所获取的质谱的前体离子落在预定强度阈值以下，那么不将所述前体离子添加到所述自动排除集中。8.根据权利要求1所述的方法，其中样品制备包含直接消化。9.根据权利要求1所述的方法，其中样品制备包含天然消化。10.根据权利要求1所述的方法，其中样品制备包含免疫沉淀。11.根据权利要求1所述的方法，其中样品制备包含基于活性的蛋白质谱分析(activity
‑
based protein profiling)。12.根据权利要求1所述的方法，其中样品制备包含分级分离。13.根据权利要求1所述的方法，其中样品制备包含过滤。14.根据权利要求1所述的方法，其中色谱步骤包括反相液相色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱、亲水相互作用色谱、混合模式色谱或其组合。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括所关注蛋白质。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述所关注蛋白质的浓度是至少一种所鉴定的HCP的浓度的至少1000倍、至少10,000倍、至少100,000倍或至少1,000,000倍。17.根据权利要求15所述的方法，其中所述所关注蛋白质是抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的Fab区、抗体
‑
药物缀合物、融合蛋白或药物。18.根据权利要求1所述的方法，其中质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪，其中所述质谱仪耦接到液相...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄瑜，M，
申请(专利权)人：瑞泽恩制药公司，
类型：发明
国别省市：