一种用于核酸提取的自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种用于核酸提取的自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体的制备方法。该制备方法包括如下步骤：制备自旋磁性氧化铁纳米棒状载体核心，再在自旋磁性氧化铁纳米棒状载体核心外包覆介孔二氧化硅，再对其进行氨基修饰，最后再使用丙烯酸修饰层修饰，得到自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体。本发明专利技术通过自旋磁性氧化铁纳米棒状载体核心、介孔二氧化硅结构层与聚丙烯酸修饰层三者的协同作用，同时实现了核酸吸附位点的提升以及核酸吸附过程中的传质速率提升，最终提升核酸提取效率。最终提升核酸提取效率。最终提升核酸提取效率。

【技术实现步骤摘要】
一种用于核酸提取的自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体的制备方法

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[0001]本专利技术涉及纳米材料和生物工程
，具体涉及一种用于核酸提取的自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体的制备方法。

技术介绍
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[0002]核酸分离纯化在分子生物学研究及临床分子诊断中具有极其重要的地位，对于分子诊断中获得的珍贵临床样本，是否能提取出高质量的核酸分子是后续给出正确分析诊断结果的关键。传统基于液相分离的核酸提取方法所需样品量大、分离时间长、易受污染、降解率高、且有机溶剂的残留显著增加了PCR抑制剂的残留风险。与液相萃取方法相比，固相萃取方法减少了有机溶剂的使用，操作相对简便，分离时间短，样品在实验过程中不易污染与降解，提取的核酸无论是浓度还是纯度都相对较高。其中，磁性微纳米材料(以下简称磁珠)分离纯化技术是目前应用最广泛的核酸提取方法，并已全面实现核酸的自动化、高通量、快速提取。磁珠法利用表面具有特定官能团(羟基、羧基或氨基)的纳米磁珠微球对核酸的选择性吸附实现核酸的分离纯化，在检测体系中，蛋白质等杂质不会与磁珠吸附，磁珠可以在磁场下聚集和分散，实现核酸与杂质的分离。磁性吸附材料是磁珠分离纯化技术的核心，由于二氧化硅(SiO2)具备良好的结合核酸的能力，SiO2包覆磁流体形成的SiO2@Fe3O4磁珠是最常用的核酸磁性分离纳米材料。然而，目前市面上核酸提取试剂盒所使用的SiO2@Fe3O4磁珠表面的SiO2涂层是密实无孔的结构，存在吸附容量小、扩散传质速度慢等不足之处。随着生物医药行业和临床诊断对核酸提取的灵敏度、提取效率、提取得率等指标的要求不断提高，研发高效、高灵敏且能提高提取过程传质速率的核酸提取新型磁性分离纳米材料具有重要意义。

技术实现思路
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[0003]本专利技术解决了现有技术存在的问题，提供一种用于核酸提取的自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体的制备方法，本专利技术提出的自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体通过自旋磁性氧化铁纳米棒状载体核心、介孔二氧化硅结构层与聚丙烯酸修饰层三者的协同作用，同时实现了核酸吸附位点的提升以及核酸吸附过程中的传质速率提升，最终提升核酸提取效率。
[0004]本专利技术的目的是提供一种用于核酸提取的自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体的制备方法，包括如下步骤：
[0005]S1：将氯化铁水溶液密封，在烘箱中静置，获得羟基氧化铁纳米棒，将所述的羟基氧化铁纳米棒分散在水中，得到羟基氧化铁纳米棒存储液；
[0006]S2：将步骤S1得到的羟基氧化铁纳米棒存储液稀释至浓度为0.0005
‑
0.0010g/mL得到羟基氧化铁纳米棒液，向羟基氧化铁纳米棒液中加入尿素、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、异丙醇和环己烷，充分混匀后，羟基氧化铁纳米棒液中羟基氧化铁纳米棒与尿素、十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1:25
‑
35:45
‑
55，异丙醇、环己烷与羟基氧化铁纳米棒液
的体积比为0.08
‑
0.12:1.4
‑
1.6:1，加入四乙氧基硅烷(TEOS)，四乙氧基硅烷与羟基氧化铁纳米棒液的体积比为0.02
‑
0.06:1，搅拌回流反应，控制不同厚度介孔二氧化硅层的包覆，冷却，水洗干燥后，获得包覆介孔二氧化硅的羟基氧化铁纳米棒(FeOOH@mSiO2)；
[0007]S3：将步骤S2得到的包覆介孔二氧化硅的羟基氧化铁纳米棒(FeOOH@mSiO2)在空气中煅烧后，然后再在氢气中煅烧还原反应后，得到黑色的包覆介孔二氧化硅的四氧化三铁纳米棒(Fe3O4@mSiO2)；
[0008]S4：将步骤S3得到的黑色的包覆介孔二氧化硅的四氧化三铁纳米棒(Fe3O4@mSiO2)分散到无水乙醇中，加入氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，搅拌回流反应，黑色的包覆介孔二氧化硅的四氧化三铁纳米棒和氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为1:5
‑
1:10，反应后的产物磁分离，洗涤干燥，获得氨基修饰的介孔二氧化硅的四氧化三铁纳米棒(Fe3O4@mSiO2‑
NH2)；
[0009]S5：将步骤S4中得到的氨基修饰的介孔二氧化硅的四氧化三铁纳米棒(Fe3O4@mSiO2‑
NH2)分散至水中，加入聚丙烯酸(PAA)，1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N
‑
羟基磺基琥珀酰亚胺(NHS)，室温搅拌，氨基修饰的介孔二氧化硅的四氧化三铁纳米棒和聚丙烯酸的质量比为4.5
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5.5:1，聚丙烯酸、1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N
‑
羟基磺基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.4
‑
1.6:1.4
‑
1.6，磁分离产物，洗涤和真空干燥后，即可得到负载聚丙烯酸的磁性介孔纳米材料，即自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体。
[0010]磁珠法是利用表面具有特定官能团(羟基、羧基或氨基)的纳米磁珠微球对核酸的选择性吸附实现核酸的分离纯化，在检测体系中，蛋白质等杂质不会与磁珠吸附，磁珠可以在磁场下聚集和分散，实现核酸与杂质的分离。磁性吸附材料是磁珠分离纯化技术的核心，由于二氧化硅(SiO2)具备良好的结合核酸的能力，SiO2包覆磁流体形成的SiO2@Fe3O4磁珠是最常用的核酸磁性分离纳米材料。然而，目前市面上核酸提取试剂盒所使用的SiO2@Fe3O4磁珠表面的SiO2涂层是密实无孔的结构，存在吸附容量小、扩散传质速度慢等不足之处。此外，现有磁珠法核酸自动提取仪在核酸吸附这一步骤中，须通过“敲打”模式促进磁珠与核酸之间的结合和吸附，磁珠材料的分散性对提取效果有很大影响。
[0011]针对这一过程，本专利技术提供一种用于核酸提取的自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体，自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体通过三重结构特征提升核酸提取效率。
[0012]第一，自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体的氧化铁纳米棒核心提供了材料实现微观自旋的结构基础，通过微观自旋大大提升了聚丙烯酸磁性介孔载体与核酸的结合效率。自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体的微观形态为椭圆形棒状结构，形状酷似搅拌子。当自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体分散液置于磁力搅拌器上时，开启磁力搅拌，自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体自身开始微观自旋，带动分散液进行自搅动。基于自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体的自旋机制，在核酸吸附步骤中，不再需要通过“敲打”模式促进磁珠与核酸之间的结合与吸附，仅需在自动提取仪底部提供磁场变换推动力(磁力搅拌器原理)，便可使自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体发生自搅动，与核酸进行充分混合和吸附，有效提升核酸吸附过程的扩散传质速率，进而提升病毒核酸提取效率。
[0013]第二，自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体中的介孔二氧化硅结构层通过提升磁性载体的比表面积。
[0014]第三，自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体中的聚丙烯酸修饰层提供了可与核酸进行特异性吸附的羧基官能团，聚丙烯酸包覆在介孔二氧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸提取的自旋性聚丙烯酸磁性介孔载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将氯化铁水溶液密封，在烘箱中静置，获得羟基氧化铁纳米棒，将所述的羟基氧化铁纳米棒分散在水中，得到羟基氧化铁纳米棒存储液；S2：将步骤S1得到的羟基氧化铁纳米棒存储液稀释至浓度为0.0005
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0.0010g/mL得到羟基氧化铁纳米棒液，向羟基氧化铁纳米棒液中加入尿素、十六烷基三甲基溴化铵、异丙醇和环己烷，充分混匀后，羟基氧化铁纳米棒液中羟基氧化铁纳米棒与尿素、十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1:25
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35:45
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55，异丙醇、环己烷与羟基氧化铁纳米棒液的体积比为0.08
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0.12:1.4
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1.6:1，加入四乙氧基硅烷，四乙氧基硅烷与羟基氧化铁纳米棒液的体积比为0.02
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0.06:1，搅拌回流反应，控制不同厚度介孔二氧化硅层的包覆，冷却，水洗干燥后，获得包覆介孔二氧化硅的羟基氧化铁纳米棒；S3：将步骤S2得到的包覆介孔二氧化硅的羟基氧化铁纳米棒在空气中煅烧后，然后再在氢气中煅烧还原反应后，得到黑色的包覆介孔二氧化硅的四氧化三铁纳米棒；S4：将步骤S3得到的黑色的包覆介孔二氧化硅的四氧化三铁纳米棒分散到无水乙醇中，加入氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌回流反应，黑色的包覆介孔二氧化硅的四氧化三铁纳米棒和氨丙基三乙氧基硅烷的质量比为1:5
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1:10，反应后的产物磁分离，洗涤干燥，获得氨基修饰的介孔二氧化硅的四氧化三铁纳米棒；S5：将步骤S4中得到的氨基修饰的介孔二氧化硅的四氧化三铁纳米棒分散至水中，加入聚丙烯酸，1
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乙基
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N
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羟基磺基琥珀酰亚胺，室温搅拌，氨基修饰的介孔二氧化硅的四氧化三铁纳米棒和聚丙烯酸的质量比为4.5
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5.5:1，聚丙烯酸、1
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乙基
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘舒芹，陈超，陈爽，赵昕，陈江韩，
申请(专利权)人：广东省科学院测试分析研究所中国广州分析测试中心，
类型：发明
国别省市：