本发明专利技术属植物基因工程技术领域，其特征是从玉米自交系Ｍｏ１７中克隆获得一种玉米根部淹水高效表达Ｚｍｚｆ基因的启动子，该启动子的核苷酸序列如序列表ＳＥＱ?ＩＤ?ＮＯ：１所示；利用本发明专利技术所提供的Ｚｍｚｆ基因的启动子，与抗虫、抗病、抗逆等目的基因连接，并应用于旱生植物的遗传转化，在涝渍、淹水等厌氧条件下，可以促进下游目的基因的高效表达，提高转基因植株根部的抗虫、抗病、抗逆境等能力；同时该启动子只在根部表达，不涉及食用转基因植物地面以上部分的食品安全问题；因此，本发明专利技术在旱生植物的耐渍遗传改良中具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及玉米根部淹水高效表达Zmzf基因的启动子，属植物基因工程技术领 域。
技术介绍
我国南方春玉米和北方夏玉米在正常的栽培季节中，经常遭受洪涝和渍害，玉米 根系长期处于低氧状态，导致玉米减产10% -40%。创制耐渍玉米新种质的途径一般有两 条，一是发掘和利用现有玉米种质或其近缘物种中的有利基因，通过杂交、回交等育种手段 或分子标记辅助选择等生物技术手段，将耐渍相关基因导入现有优良玉米育种材料中。然 而，玉米及其近缘种耐渍资源的缺乏，至今未培育出耐渍性较强的新种质。二是利用基因工 程技术对玉米进行耐渍性遗传改良。由于植物耐渍分子机理的复杂性，尽管已经克隆出了 一些与耐渍相关的基因、顺式元件及转录因子，但仍然不能解决生产中遇到的实际问题。玉米Zea mays bZip factor基因，筒称为Zmzf■基因(下同)。Zmzf■基因的启动 子含有厌氧反应相关的ARE和GC-motif顺式元件，是典型的厌氧响应启动子。Zmzf基因启 动子的克隆，目前尚未见有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是从玉米自交系Mol7中克隆玉米根部淹水高效表达Zmzf基因的启 动子，并利用该启动子对旱生植物的耐渍性进行遗传改良。本专利技术的技术方案是1.玉米自交系Mo 17叶片总DNA的提取取玉米叶片5. 0g于液氮中研磨，转入50ml离心管中。加预热至95°C的CTAB 缓冲液(1.17M NaCL、0.0016M EDTA-8. 0,0. 835M Tris-7. 5,1. 6 % CTAB, 1 % 疏基乙 醇)10ml，混勻。在65°C水浴锅内反应90分钟，不时轻摇离心管。取出离心管，待冷至室温 后，加入等体积氯仿异醇(24 1)，小心摇动试管10分钟。SOOOrpm离心10分钟，将上 清转至另一 50ml离心管中。加2/3体积异丙醇，小心混勻，将棉絮状DNA转入盛10ml 70% 乙醇的50ml离心管中，浸泡12小时。倒掉70%乙醇，将DNA晾干，加入1ml TE溶液溶解。 待DNA完全溶解后，转入2. 0ml离心管中，加入10 yl 10mg/ml RNaseA，混勻；在37°C下， 温育2小时。再用1ml苯酚氯仿异戊醇(25 24 1)抽提一次，8000rpm离心10分 钟。将上清液转入2. 0ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC(pH5. 2)，2/3体积异丙醇沉 淀DNA。将棉絮状DNA转入2. 0ml离心管中，用70%乙醇洗涤一次，短暂离心，使DNA贴壁， 倒去70%乙醇，晾干DNA。待DNA晾干后，加入0. 5ml TE溶液，完全溶解DNA，于_20°C长期 保存。2. Zmzf基因启动子的克隆根据Zmzf基因第一个外显子，设计、合成3个特异性右引物(Bf l、Bf2、Bf3)，分别 与4个简并引物(AD1、AD2、AD3、AD4)进行TAIL-PCR扩增。回收第三轮的扩增产物，并连接到pGEM-T easy载体上，进行DNA测序。根据测序所得的DNA序列再设计、合成3个特异性 右引物，重复上述实验，不断进行TAIL-PCR扩增。当所得序列向前延伸近2Kb左右，将DNA 序列拼接起来，进行生物信息学分析。TAIL-PCR 第一轮扩增2. 5u 1 10XPCR 缓冲液，2 u 1 10mM dNTPs, 1 u 1 lOmM 特 异引物Bfl，liU lOmM简并引物(AD)，1单位Taq酶，40ng模板DNA，总体积25iU。TAIL-PCR 扩增程序为92°C 3分钟，95°C 1分钟；94°C 30秒，65 °C 1分钟，72°C 2分钟，循环5次； 94°C 30 秒，25 °C 2 分钟，Rampingto 72 °C 2 分钟，72 °C 2 分钟；94°C 30 秒，65°C 1 分钟，72 °C 2 分钟，94°C 30秒，65°C 1分钟，72 °C 2分钟，94°C 30秒，44°C 1分钟，72 °C 2分钟，循环15次; 72 °C 5分钟。TAIL-PCR第二轮扩增取第一轮的PCR产物1 ill，再加入39 ill ddH20，稀释40 倍。2.5iil 10XPCR 缓冲液，2ii 1 10mM dNTPs, 1 u 1 lOmM特异引物 Bf2，1 ii 1 lOmM 简并引 物(AD)，1单位Taq酶，1 yl稀释40倍的第一轮TAIL-PCR产物，总体积25 yl。TAIL-PCR 扩增程序为94°C 30秒，65°C 1分钟，72°C 2分钟，94°C 30秒，65°C 1分钟，72°C 2分钟， 94°C 30秒，45°C 1分钟，72°C 2分钟，循环12次；72°C 5分钟。TAIL-PCR第三轮扩增取第二轮的PCR产物1 iil，再加入9 ill ddH20，稀释10倍。 2. 5u 1 10XPCR 缓冲液，2ii 1 10mM dNTPs, 1 u 1 lOmM 特异引物 Bf3，1 ii 1 lOmM 简并引物 (AD)，1单位Taq酶，1 yl稀释10倍的第二轮TAIL-PCR产物，总体积25 yl。TAIL-PCR扩 增程序为:94°C 40秒，45°C 1分钟，72°C 2分钟，循环20次；72°C 1分钟。3.转化载体的构建使用带酶切位点的引物，以玉米自交系Mol7的DNA为模板进行PCR扩增。将PCR 产物与pGEM-T easy载体连接，转化Escherichia coli DH5 a，生长在含氨苄青霉素、X_Gal 和IPTG的LB固体平板上的白色菌株被分离出来。经PCR检测，选择阳性克隆进行DNA测 序，提取所克隆Zmzf基因启动子序列正确的质粒DNA。使用限制性内切酶酶切质粒，琼 脂糖凝胶电泳，回收Zmzf启动子片段。使用相对应的内切酶酶切PBI121载体，将Zmzf基 因启动子构建到PBI121载体中，构建成pBI121-Zmzf-GUS载体，转化到农杆菌GV3101菌株中。对所克隆的Zmzf基因的启动子进行DNA测序，其核苷酸序列如下序列表SEQ ID NO 1<110>长江大学<120>玉米淹水诱导高效表达Zmzf基因的启动子<130><160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>2008<212>DNA<213>Zea mays<220><221>promoter4<222>⑴ (2008)<400>1gttttgaggtcgattggagttacggattttagttagcaacatttttactaacataacatc60aatctgtccagtattataaaactgcaatgttttggttttgtgatgattaggagaaggcga120tttaagcttccacaatcattcattccctctgattgtctactttagcatca180tacaatcctaaatattatatatcacaagaaaattcataggttctttacacatcagttgtt240ttagctataaatttta本文档来自技高网...
【技术保护点】
玉米根部淹水高效表达Ｚｍｚｆ基因的启动子，其特征在于启动子的核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜何为，张祖新，黄敏，许先凤，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：42[中国|湖北]
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