活性改善的Cas蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明专利技术提供了一种Cas突变蛋白，具有广泛的应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
活性改善的Cas蛋白及其应用


[0001]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)
具体而言，本专利技术涉及一种活性提高的Cas蛋白及其应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。
[0003]CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，它识别3
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NGG的PAM基序，对靶标序列进行平末端切割。CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5
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TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。例如Cas9,C2c1和CasX均需要两条RNA进行指导RNA，而Cpf1只需要一条指导RNA而且可以用来进行多重基因编辑。CasX具有980个氨基酸的大小，而常见的Cas9，C2c1，CasY和Cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，Cas9，Cpf1，CasX，CasY的PAM序列都比较复杂多样，而C2c1识别严谨的5
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TTN，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。
[0004]中国专利技术专利CN111757889B中公开了一种Cas蛋白Cas12f.4，还公开了该蛋白可以在真核细胞中进行基因编辑，但是，其编辑活性并不高，为了提高该蛋白的编辑效率，本申请对该蛋白进行了优化，提高了其在真核细胞中的编辑效率。

技术实现思路

[0005]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，通过对Cas12f.4(本申请中将其称之为，Cas12i3或Cas12i.3)蛋白的定点突变，提高了其编辑活性，扩展了其应用范围。
[0006]Cas效应蛋白
[0007]一方面，本专利技术提供了一种活性改善的Cas突变蛋白，所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个(例如，任意2个、任意3个、任意4个、任意5个、任意6个、任意7个、任意8个或任意9个)氨基酸位点处存在突变：第328位、第369位、第398位、第432位、第433位、第941位、第942位、第945位或第964位。
[0008]在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白在上述第328位氨基酸位点处存在突变；进一步的，在第328位氨基酸突变的基础上，还包括选自上述第369位、第398位、第432位、第433位、第941位、第942位、第945位或第964位氨基酸位点的任意1个、任意2个、任意3个、任意4个、任意5个、任意6个、任意7个或任意8个氨基酸位点突变。
[0009]在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白在上述第369位氨基酸位点处存在突变；进一步的，在上述第369位氨基酸突变的基础上，还包括选自上述第328位、第398位、第432位、第433位、第941位、第942位、第945位或第964位氨基酸位点的任意1个、任意2个、任意3个、
任意4个、任意5个、任意6个、任意7个或任意8个氨基酸位点突变。
[0010]在一个实施方式中，所述Cas突变蛋白在上述第328位氨基酸位点处存在突变；进一步的，在上述第328位氨基酸突变的基础上，还包含选自上述第369位、第433位、第942位或第945位氨基酸位点处的任一或任意几个(例如，任意2个、任意3个或任意4个)氨基酸突变。例如，第328位和第369位同时突变，第328位和第433位同时突变，第328位、第369位和第433位同时突变，第328位、第369位、第433位、第942位和第945位同时突变。
[0011]在其他的实施方式中，所述Cas突变蛋白在上述第369位氨基酸位点处存在突变；进一步的，在第369位氨基酸突变的基础上，还包含选自上述第433位、第942位或第945位氨基酸位点处的任一或任意几个(例如，任意2个、任意3个)氨基酸突变。例如，第369位和第433位同时突变，第369位和第942位同时突变，第369位和第945位同时突变，第369位、第433位、第942位和第945位同时突变。
[0012]在其他的实施方式中，所述Cas突变蛋白在上述第433位氨基酸位点处存在突变；进一步的，在第433位氨基酸突变的基础上，还包含选自上述第942位或第945位氨基酸位点处的任一或2个氨基酸突变。例如，第433位和第942位同时突变，第433位和第945位同时突变。
[0013]在一个实施方式中，第328位氨基酸突变为非E的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，S，K，N，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0014]在一个实施方式中，第369位氨基酸突变为非N的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，S，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0015]在一个实施方式中，第398位氨基酸突变为非F的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，N，W，Y，D，S，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0016]在一个实施方式中，第432位氨基酸突变为非Q的氨基酸，例如，A，V，G，L，F，N，W，Y，D，S，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0017]在一个实施方式中，第433位氨基酸突变为非S的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0018]在一个实施方式中，第941位氨基酸突变为非N的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，S，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0019]在一个实施方式中，第942位氨基酸突变为非K的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，S，E，N，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0020]在一个实施方式中，第945位氨基酸突变为非N的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，D，S，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0021]在一个实施方式中，第964位氨基酸突变为非D的氨基酸，例如，A，V，G，L，Q，F，W，Y，N，S，E，K，M，T，C，P，H，R，I；优选，R。
[0022]在一个实施方式中，所述亲本Cas蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1相比具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。
[0023]在一些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Cas突变蛋白，所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第369位、第433位、第328位、第398位、第432位、第941位、第942位、第945位或第964位。2.根据权利要求1所述的Cas突变蛋白，其特征在于，所述Cas突变蛋白选自以下(1)
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(3)任意一组：(1)所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第369位氨基酸位点处存在突变；进一步的，所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第328位、第398位、第432位、第433位、第941位、第942位、第945位或第964位氨基酸位点的任意1个、任意2个、任意3个、任意4个、任意5个、任意6个、任意7个或任意8个氨基酸位点处还存在突变；(2)所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第328位氨基酸位点处存在突变；进一步的，所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第369位、第398位、第432位、第433位、第941位、第942位、第945位或第964位氨基酸位点的任意1个、任意2个、任意3个、任意4个、任意5个、任意6个、任意7个或任意8个氨基酸位点处还存在突变；(3)所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第433位氨基酸位点处存在突变；进一步的，所述突变蛋白与亲本Cas蛋白的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第942位或第945位氨基酸位点的任意1个或2个氨基酸位点处还存在突变。3.根据权利要求1所述的Cas突变蛋白，其特征在于，所述亲本Cas蛋白来源于Cas12i家族蛋白，优选，Cas12i3。4.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1
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3任一所述的Cas突变蛋白以及其他的修饰部分。5.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1
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3任一所述Cas突变蛋白的多核苷酸序列，或编码权利要求4所述融合蛋白的多核苷酸序列。6.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求5所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。7.一种CRISPR
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Cas系统，其特征在于，所述系统包括权利要求1
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3任一所述的Cas突变蛋白以及至少一种gRNA；所述gRNA能够结合权利要求1
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3任一所述的Cas突变蛋白。8.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含：(i)蛋白组分，其选自：权利要求1
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3任一所述的Cas突变蛋白或权利要求4所述的融合蛋白；(ii)核酸组分，其为gRNA，所述gRNA能够结合权利要求1
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3任一所述的Cas突变蛋白；所述蛋白组分与核酸组分相互结合形成复合物。9.一种活化的CRISPR复合物，所述活化的CRISPR复合物包含：(i)蛋白组分，其选自：权利要求1
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3任一所述的Cas突变蛋白或权利要求4所述的融合蛋白；(ii)核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志强，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：