一种用于构建大豆新品种的sgRNA组合及培育大豆新品种的方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，提供了一种用于构建大豆新品种的sgRNA组合及培育大豆新品种的方法和应用。所述sgRNA组合包括sgRNA

【技术实现步骤摘要】
一种用于构建大豆新品种的sgRNA组合及培育大豆新品种的方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种用于构建大豆新品种的sgRNA组合及培育大豆新品种的方法和应用。

技术介绍

[0002]大豆(Glycine max L.)是一种重要的粮食作物，为人类提供优质蛋白和植物油等。大豆油在常用植物油中占有重要地位，大豆油的品质主要由脂肪酸组成决定，通常大豆含有13％的棕榈酸、4％的硬脂酸、20％的油酸、55％的亚油酸和8％的亚麻酸。油酸含量增高时，单不饱和脂肪酸增多可以延长大豆油保质期，还可以减少对氢化反应的需求，而氢化反应会增加压榨工艺的成本，并产生不必要的反式脂肪，进一步影响人类的健康(Ascherio A,Willett W C.Health effects of trans fatty acids[J].Am J Clin Nutr,1997,66:1006
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1010.)。此外，在生产生物柴油时，需要油酸含量高，饱和脂肪酸含量低的油，来提高氧化稳定性和增加冷流量。油酸含量高的大豆油氧化稳定性提高也会打开多种食品和工业应用，如喷涂油和机器润滑剂(Butzen S,Schnebly S.High oleic soybean.Crop Insights[J],2007,17(7):3)。成熟的大豆中还存在有一种特殊的风味从而限制了大豆产品的开发应用。这种风味主要是脂氧合酶(LOXs)催化亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸的氧化，产生共轭不饱和脂肪酸氢过氧化物转化生成的挥发性化合物。在食品加工业中，通常通过加热、微波加工和有机溶剂萃取等方法来消除豆制品(油、豆浆等)中的豆腥味，但也增加了生产和加工成本(Brash AR.Lipoxygenases:occurrence,functions,catalysis,and acquisition of substrate[J].JBiol Chem,1999,274:23679
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23682)。培育广适性高油酸不含脂氧合酶的大豆品种是一种很有效的策略，可以从根源解决问题，在不损失成本的情况下，消除大豆风味，提高大豆油品质。
[0003]大豆FAD2基因家族先前在基因组水平上的结构和表达已被鉴定。在大豆中鉴定出的FAD2基因中，FAD2
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2去饱和酶包括FAD2
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2A(Glyma19g32930)、FAD2
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2B(Glyma19g32940)和FAD2
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2C(Glyma03g30070)，FAD2
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2去饱和酶在大豆植物的营养组织中广泛表达。FAD2
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2A为例外，未检测到其表达，FAD2
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2A编码区缺失100bp，预测为无功能。两种微粒体FAD2
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1去饱和酶FAD2
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1A(Glyma10g42470)和FAD2
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1B(Glyma20g24530)主要在发育中的种子中表达(Okuley J,Lightner J,Feldmann K,Yadav N,Lark E,Browse J.Arabido psis FAD2 gene encodes the enzyme that is essential for polyunsaturated li pid synthesis[J].The Plant cell,1994,6:147
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158)。因此认为FAD2
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1A和FAD2
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1B在大豆种子发育过程中对油酸水平的控制起着重要作用。
[0004]成熟大豆种子主要含有三种脂氧合酶同工酶LOX1、LOX2和LOX3，分别编码Glyma.13g347600(GmLOX1)、Glyma.13g347500(GmLOX2)和Glyma.15g026300(GmLOX3)。这些同工酶参与豆味的形成，LOX2是主要的同工酶。单、双、三脂氧合酶同工酶的天然或人工突变体已被鉴定，并利用这些突变系开发了一系列缺乏脂氧合酶的大豆品种。在无脂氧合酶
大豆品种的选育过程中，通常需要进行回交或自交和几代轮选，这是一个费时费力的过程(Bai M,Yuan J,Kuang H,Gong P,Li S,Zhang Z,Liu B,Sun J,Yang M,Yang L,Wang D,Song S,Guan Y.Generation ofa multiplex mutagenesis population via pooled CRISPR
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Cas9 in soyabean[J].Plant Biotechno J,2020,18(3):721
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731)。
[0005]CRISPR/Cas9作为最新出现的基因编辑技术，是由RNA引导Cas9蛋白核酸酶在特定的位点对靶向基因组进行切割和修饰，从而实现基因敲除、插入、替换和染色体重组。其作为反向遗传学中研究基因功能的一种重要工具，具有载体构建简单、靶向特异性高等特点。且利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创造的突变体可以通过自交繁殖去除载体，这类去除载体的突变体有期望用于植物生产。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于构建大豆新品种的sgRNA组合及培育大豆新品种的方法和应用，所述方法能够获得具有高含量油酸和低含量脂氧合酶的大豆编辑材料，为大豆育种提供了宝贵的基因资源、种质资源和资源鉴定方法。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种用于构建大豆新品种的sgRNA组合，包括sgRNA
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GmLOX1、sgRNA
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GmLOX2、sgRNA
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GmLOX3和sgRNA
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GmFAD2
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1A/B，所述sgRNA
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GmLOX1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述sgRNA
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GmLOX 2的序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA
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GmLOX3的序列如SEQ ID NO.3所示，所述sgRNA
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GmFAD2
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1A/B的序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]本专利技术提供了一种CRISPR/Cas9编辑用表达载体组合，包括第一表达载体和第二表达载体；
[0010]所述第一表达载体通过将权利要求1所述的sgRNA
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GmLOX1、sgRNA
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GmLOX2、sgRNA
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GmLOX3克隆至初始表达载体pBSE401上获得；所述第二表达载体通过将sgRNA
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GmFAD2
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1A/B克隆至初始表达载体pBSE401上获得。
[0011]本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于构建大豆新品种的sgRNA组合，其特征在于，包括sgRN A
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GmLOX1、sgRNA
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GmLOX2、sgRNA
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GmLOX3和sgRNA
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GmFAD2
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1A/B，所述sgRNA
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GmLOX1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述sgRNA
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GmL OX2的序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA
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GmLOX3的序列如SEQ ID NO.3所示，所述sgRNA
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GmFAD2
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1A/B的序列如SEQ ID NO.4所示。2.一种CRISPR/Cas9编辑用表达载体组合，其特征在于，包括第一表达载体和第二表达载体；所述第一表达载体通过将权利要求1所述的sgRNA
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GmLOX1、sgRNA
‑
GmLOX2、sgRNA
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GmLOX3克隆至初始表达载体pBSE401上获得；所述第二表达载体通过将sgRNA
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GmFAD2
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1A/B克隆至初始表达载体pBSE401上获得。3.一种利用CRISPR/Cas9技术构建大豆新品种的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱丽娟，何梓莹，于莉莉，邱红梅，洪慧龙，高华伟，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：