参七糖络方对T2DM大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的影响研究制造技术

本发明专利技术公开了参七糖络方对T2DM大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的影响研究，包括准备80只为体重(200

【技术实现步骤摘要】
参七糖络方对T2DM大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的影响研究


[0001]本专利技术涉及参七糖络方对骨骼肌IR研究
，具体为胰岛素参七糖络方对T2DM大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的影响研究。

技术介绍

[0002]IR指人体胰岛素作用的靶器官对胰岛素敏感性降低，从而降低机体对葡萄糖摄取与利用能力，使人体胰岛素分泌障碍造成人体糖脂代谢紊乱等的病理环节，骨骼肌做为胰岛素主要作用靶组织之一，其调节葡萄糖摄取和利用的功能主要通过细胞内的胰岛素信号传导通路实现，在T2DM及IR的整个发生发展过程中起重要作用，二甲双胍可以提高胰岛素敏感性，促进骨骼肌对外周葡萄糖的摄取与利用能力，是当前临床上用以改善IR、治疗T2DM的一线用药，但其易使患者发生胃肠道不良反应等副作用，且一经停药血糖易发生反弹；中医药善于调治慢性疾病，验方参七糖络方，可清热泻火、益气滋阴、通络降糖，IRS1/PI3K/GLUT4通路是在骨骼肌中促进葡萄糖转运的主要机制，也是促进胰岛素合成与代谢及稳定血糖的重要胰岛素信号通路，当其发生传导障碍时，会影响骨骼肌对葡萄糖的摄取与利用，导致IR，此外当前有诸多研究已经验证多种miRNA参与胰岛素信号转导途径调控，其表达失调与IR发生及T2DM密切相关，其中miRNA144在IRS1的3'UTR区与其含有两个结合靶点，当miRNA144高表达时会抑制IRS1，进而损伤胰岛素信号转导途径，参七糖络方临床疗效颇佳，但其治疗T2DM的具体作用机制尚不明确，本实验旨在通过观察miRNA144介导下参七糖络方对T2DM模型大鼠IRS1/PI3K/GLUT4胰岛素信号传导通路相关蛋白及miRNA表达的影响，以明确参七糖络方对T2DM大鼠的疗效并探讨该方对T2DM大鼠骨骼肌IR的作用机制。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供参七糖络方对T2DM大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的影响研究，以解决上述
技术介绍
中提出现有的参七糖络方对T2DM具体作用机制尚不明确的问题。
[0004]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：参七糖络方对T2DM大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的影响研究，包括以下实验步骤：步骤一：准备80只为体重(200
±
20)g的SPF级雄性SD大鼠，SD大鼠每日自由摄食与饮水饲养1周后，采用随机数字表法选取12只做为空白组（CK），饲喂普通饲料，其余大鼠均给予高糖高脂饲料喂养，4周后禁食不禁水12 h，一次性腹腔注射列脲佐菌素（STZ）30mg/kg，继续高脂饲料饲喂1周，1周后尾静脉采血测量血糖，空腹血糖稳定≥11.1 mmol/L的大鼠视为建立糖尿病大鼠模型，不符合者剔除；步骤二：将造模成功的60只SD大鼠分为模型组（M）、二甲双胍组（MET）、参七糖络方低剂量组（SQ
‑
L）、参七糖络方中剂量组（SQ
‑
Z）和参七糖络方高剂量组（SQ
‑
H），每组随机12只SD大鼠，空白组（CK）与模型组（M）以等体积生理盐水每天灌胃一次，二甲双胍组（MET）以0.18g/kg/d的二甲双胍药液灌胃，参七糖络方低剂量组（SQ
‑
L）、参七糖络方中剂量组（SQ
‑
Z）和参七糖络方高剂量组（SQ
‑
H）分别以13.40g/kg/d、26.80g/kg/d、53.60g/kg/d的参七糖络方药液灌胃，每组SD大鼠连续灌胃4周，并每日观察大鼠饮食饮水、皮毛光泽度、大小便及精神状态，每周同时间测定其空腹血糖（FBG）和体重；步骤三：给药干预后第4周，大鼠禁食不禁水12h，然后灌胃葡萄糖溶液2g/kg，分别在 0、15、30、60、120min时尾尖采血，测量血糖并记录；步骤四：末次给药治疗后，大鼠禁食不禁水12h，并测量各组大鼠FBG与口服葡萄糖糖耐量（OGTT），在麻醉后一次性采血管心脏采血，血液置于离心管中在4℃环境下静置1h，之后用低温离心机以3000r/min离心10min，移液器抽取血清，用EP管分装后置于
‑
80℃冰箱冻存；步骤五：分离骨骼肌（左右后肢腓肠肌），用生理盐水清洗毛发和血渍，滤纸吸干水分，左后肢腓肠肌用4%甲醛溶液固定，常温保存，右后肢腓肠肌装入冻存管中置于
‑
80℃冰箱冻存；步骤六：将固定组织经全自动脱水机脱水、包埋、切片，切片后切片脱蜡至水浸泡，苏木精染色10
‑
20 min后自来水冲洗1
‑
3min，并通过盐酸酒精分化5
‑
10s，之后自来水冲洗1
‑
3min放入50℃的温水中或弱碱性水溶液返蓝，直到出现蓝色为止，再自来水冲洗1
‑
3min，放入85%的酒精3
‑
5min，伊红染色3
‑
5 min并水洗3
‑
5s，使用梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固；步骤七：采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测大鼠血清空腹胰岛素（FINS） 分泌水平、糖化血红蛋白（GHb）含量；采用生化分析法检测大鼠血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL
‑
C）、低密度脂蛋白（LDL
‑
C）含量，检测骨骼肌组织中肌糖原含量；步骤八：采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测骨骼肌胰岛素受体（INSR）、胰岛素受体底物1(IRS1)、P
‑
IRS1、磷脂酰肌醇3
‑
激酶p85（PI3K p85）、P
‑
PI3Kp85、蛋白激酶B（AKT）、P
‑
AKT及葡萄糖转运体4（GLUT4）蛋白的表达水平；步骤九：实时荧光定量PCR（qPCR）检测骨骼肌INSR、IRS1、PI3Kp85、AKT、GLUT4及miRNA144mRNA的表达。
[0005]作为本专利技术的优选技术方案，所述SPF级雄性SD大鼠在温度为21
‑
25 ℃，相对湿度50
ꢀ‑
60%，噪声<50dB的实验环境下饲养。
[0006]作为本专利技术的优选技术方案，所述步骤二中二甲双胍药液制备盐酸二甲双胍片根据大鼠灌胃体积10 ml/kg加入生理盐水，配制成含药浓度18mg/1ml的药液，搅拌均匀，装入高温灭菌的玻璃瓶中，放入4℃冰箱保存；参七糖络方药液制备以葛根、知母、黄连、黄芩、苦瓜、僵蚕、干姜、西洋参、三七按量称取药材（组方药物饮片购于甘肃中医药大学附属医院药剂科），加入8倍量蒸馏水，浸泡30min后，葛根先煎20min，再加入其余药物，药物沸煮后文火煎煮60min，滤液由筛网筛滤出，加8倍量蒸馏水于药物残渣中重复前次煎煮过程，将两次筛滤得到的滤液混合，使用旋转蒸发仪进行浓缩，得到含生药1.34 g/ml、2.68 g/ml、5.36 g/ml的药液，待其冷却后装入高温灭菌的玻璃瓶中，放入4℃冰箱保存备用。
[0007]作为本专利技术的优选技术方案，所述步骤三中在血糖测量记录后，计算曲线下面积（Area under t本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.参七糖络方对T2DM大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的影响研究，其特征在于，包括以下实验步骤：步骤一：准备80只为体重(200
±
20)g的SPF级雄性SD大鼠，SD大鼠每日自由摄食与饮水饲养1周后，采用随机数字表法选取12只做为空白组（CK），饲喂普通饲料，其余大鼠均给予高糖高脂饲料喂养，4周后禁食不禁水12 h，一次性腹腔注射列脲佐菌素（STZ）30mg/kg，继续高脂饲料饲喂1周，1周后尾静脉采血测量血糖，空腹血糖稳定≥11.1 mmol/L的大鼠视为建立糖尿病大鼠模型，不符合者剔除；步骤二：将造模成功的60只SD大鼠分为模型组（M）、二甲双胍组（MET）、参七糖络方低剂量组（SQ
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L）、参七糖络方中剂量组（SQ
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Z）和参七糖络方高剂量组（SQ
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H），每组随机12只SD大鼠，CK组与模型组（M）以等体积生理盐水每天灌胃一次，二甲双胍组（MET）以0.18g/kg/d的二甲双胍药液灌胃，参七糖络方低剂量组（SQ
‑
L）、参七糖络方中剂量组（SQ
‑
Z）和参七糖络方高剂量组（SQ
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H）分别以13.40g/kg/d、26.80g/kg/d、53.60g/kg/d的参七糖络方药液灌胃，连续灌胃4周，并每日观察大鼠饮食饮水、皮毛光泽度、大小便及精神状态，每周同时间测定其空腹血糖（FBG）和体重；步骤三：给药干预后第4周，大鼠禁食不禁水12h，然后灌胃葡萄糖溶液2g/kg，分别在 0、15、30、60、120min时尾尖采血，测量血糖并记录；步骤四：末次给药治疗后，大鼠禁食不禁水12h，并测量各组大鼠FBG与口服葡萄糖糖耐量（OGTT），在麻醉后一次性采血管心脏采血，血液置于离心管中在4℃环境下静置1h，之后用低温离心机以3000r/min离心10min，移液器抽取血清，用EP管分装后置于
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80℃冰箱冻存；步骤五：分离骨骼肌（左右后肢腓肠肌），用生理盐水清洗毛发和血渍，滤纸吸干水分，左后肢腓肠肌用4%甲醛溶液固定，常温保存，右后肢腓肠肌装入冻存管中置于
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80℃冰箱冻存；步骤六：将固定组织经全自动脱水机脱水、包埋、切片，切片后切片脱蜡至水浸泡，苏木精染色10
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20 min后自来水冲洗1
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3min，并通过盐酸酒精分化5
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10s，之后自来水冲洗1
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3min放入50℃的温水中或弱碱性水溶液返蓝，直到出现蓝色为止，再自来水冲洗1
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3min，放入85%的酒精3
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5min，伊红染色3
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5 min并水洗3
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5s，使用梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固；步骤七：采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测大鼠血清空腹胰岛素（FINS） 分泌水平、糖化血红蛋白（GHb）含量；采用生化分析法检测大鼠血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL
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C）、低密度脂蛋白（LDL
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C）含量，检测骨骼肌组织中肌糖原含量；步骤八：采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测骨骼肌胰岛素受体（INSR）、胰岛素受体底物1(IRS1)、P
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IRS1、磷脂酰肌醇3
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激酶p85（PI3K p85）、P
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PI3Kp85、蛋白激酶B（AKT）、P
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AKT及葡萄糖转运体4（GLUT4）蛋白的表达水平；步骤九：实时荧光定量PCR（qPCR）检测骨骼肌INSR、IRS1、PI3Kp85、AKT、GLUT4及miRNA144mRNA的表达。2.根据权利要求1所述的参七糖络方对T2DM大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的影响研究，其特征在于，SPF级雄性SD大鼠在温度为21
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25 ℃，相对湿度50
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60%，噪声<50dB的实验环境下饲养。
3.根据权利要求1所述的参七糖络方对T2DM大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的影响研究，其特征在于，所述步骤二中二甲双胍药液制备盐酸二甲双胍片根据大鼠灌胃体积10 ml/kg加入生理盐水，配制成含药浓度18mg/1ml的药液，搅拌均匀，装入高温灭菌的玻璃瓶中，放入4℃冰箱保存；参七糖络方药液制备以葛根、知母、黄连、黄芩、苦瓜、僵蚕、干姜、西洋参、三七按量称取药材（组方药物饮片购于甘肃中医药大学附属医院药剂科）...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖露露，李钦，梁永林，崔泽方，
申请(专利权)人：甘肃中医药大学，
类型：发明
国别省市：