VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法技术

本发明专利技术公开了VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法。本发明专利技术通过构建过表达载体、基因敲除和基因沉默载体，转化至农杆菌后通过农杆菌侵染的方法，得到转基因过表达愈伤组织（PRI

【技术实现步骤摘要】
VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程和基因工程
，具体涉及一种VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法。

技术介绍

[0002]单宁是一种广泛存在于葡萄中的多酚类化合物，其含量的多少影响葡萄酒的色泽及口感，对研究食品抗氧化，清除自由基等功能具有重要意义。
[0003]植物中的单宁主要通过类黄酮通路合成，以苯丙氨酸作为代谢底物，在苯丙氨酸解氨酶的作用下生成肉桂酸，肉桂酸在肉桂酸4
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羟化酶的催化下生成香豆酸，接着由4
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香豆酸辅酶A连接酶催化形成4
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香豆酰
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CoA，4
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香豆酰
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CoA同丙二酰
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CoA共同合成查尔酮，查尔酮在查尔酮异构酶作用下产生无色柚皮素，为进一步在类黄酮途径下合成单宁提供条件，其中能够合成花青素还原酶的ANR基因在类黄酮通路中是控制单宁合成关键基因。
[0004]目前，我国葡萄酒产业正处于快速发展期，我国酿酒葡萄优质产区宁夏、新疆等地在气候上呈现日照强，积温高等特点，导致种植的酿酒葡萄普遍存在糖高酸低，单宁积累量不足，品质不协调等问题。为了改善葡萄酒的感官特点，常常选择添加化学合成的单宁改善葡萄酒品质，该方法不仅成本高，而且由于人工合成的单宁与葡萄自然产生单宁组成存在差异，使葡萄酒的风味不协调，因此，外源添加单宁的应用效果仍有较大提升空间。
[0005]因此，发掘一种高效合成酿酒葡萄单宁的方法是目前我国酿酒产业发展的迫切需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术为解决现有酿酒产业单宁不足的问题，提供一种VvMYBPro基因及应用和高效合成单宁的方法。
[0007]为了实现以上目的，本专利技术采用如下技术方案：VvMYBPro基因在酿酒葡萄赤霞珠愈伤组织细胞工厂高效合成葡萄单宁的应用。
[0008]VvMYBPro基因编码序列为：
[0009]ATGGGGAGAGCTCCATGTTGTGAGAAGATGGGGTTGAAGAAAGGTCCATGGACTCCCGAAGAAGATCAGATTTTGGTCAATTACATCCACCTTTATGGCCATGGAAACTGGAGGGCACTTCCCAAACAAGCTGGCTTATTGAGGTGTGGAAAGAGTTGCAGACTTCGATGGACGAATTATCTGAGGCCGGATATCAAACGGGGAAACTTCACCAGTGAAGAAGAAGAAACCATCATCGAGTTACATGAAAGGCTGGGCAATAGATGGTCAGCGATAGCAGCGAAACTACCGGGGAGGACAGACAATGAGATAAAAAATGTGTGGCACACCCACTTGAAGAAGAGGCTCAAGCACAACCACGCCACGCCACCCCCTAAAAGACACTCTCTTGATGCGTCCCAAGTCGAAAAACAACAAAACCCCATTAATTCTGCAACCAATTCGAGATCGGAGAGCCTTGGGTATGGACCAGTACTGTCCCCACAGCCGTCCTTTAGCGATATCTCCTCAGCCGCCACCACCACGACCACCACGACCACCGCCACCATGTCCGACATTACTACACCCTGCATTAAGGTCGATTCACCGGAGGATTTCCCAGAAATGGACGAGAATTTCTGGTCGGAAGTACTGTCATCCAACAAATCCGGCGCGGCGGGTGATTTGCCAGGGGCGGCCAGTGGTCCACAGCTTCAGTTTCCATTCTCTCCGCGTGCTGTCATTGGCAGTAGTCCATATAGCACGTATGACAT
GGACATGGAATTTTGGTACAATATTTTCACAAGGTCCGGGGAGTTGCATGAATTATCAGAAATATGA。
[0010]一种利用VvMYBPro基因高效合成单宁的方法，利用基因VvMYBPro构建过表达载体，侵染至赤霞珠愈伤组织，通过培养提高单宁合成量。
[0011]所述赤霞珠愈伤组织获得培养方法为：在葡萄花序变大、小花蕾之间刚刚分离开始于田间采集葡萄花序，将花序切成花生粒大小，在MS培养基接种消毒后的花序，接种外植体后放入组培室于25℃黑暗条件下培养，4周继代一次。
[0012]转基因赤霞珠愈伤组织培养条件为：侵染后将愈伤转移至表面铺一张无菌滤纸的新的继代培养基，暗培养2
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4天，将转基因愈伤组织转移至含有卡那、头孢、羧卞霉素的选择培养基上，诱导转基因愈伤，后续每隔4周更换继代至新的选择培养基上，24
±
2℃下遮光培养，直至农杆菌侵染的材料表面长出一层新的愈伤组织，将其转移进行扩繁。
[0013]优选第3天将转基因愈伤组织转移至含有卡那、头孢、羧卞霉素的选择培养基上。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具备以下优点：
[0015]1、本专利技术中过表达VvMYBPro基因能够提高类黄酮通路中单宁合成相关基因ANR和LAR2的表达，从而促进葡萄愈伤中单宁含量的积累。
[0016]2、本专利技术方法可稳定合成单宁。
附图说明
[0017]图1是荧光镜下拍摄的转基因组织。
[0018]图2是不同转基因愈伤中VvMYBPro基因表达量的分析
[0019]图3是使用RT
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qPCR方法对PRI
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MYBPro愈伤和含有空载(EV)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤中单宁合成相关基因表达量的分析；
[0020]图4是使用RT
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qPCR方法对Crispr
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MYBPro愈伤和含有空载(Crispr
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Cas9)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤中单宁合成相关基因表达量的分析；
[0021]图5是使用RT
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qPCR方法对RNAi
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MYBPro愈伤和含有空载(EV)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤中单宁合成相关基因表达量的分析；
[0022]图6是PRI
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MYBPro愈伤和含有空载(EV)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤同时用同种条件进行培养，其单宁含量的分析；
[0023]图7是Crispr
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MYBPro愈伤和含有空载(Crispr
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Cas9)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤同时用同种条件进行培养，其单宁含量的分析；
[0024]图8是RNAi
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MYBPro愈伤和含有空载(EV)的对照愈伤以及野生型(WT)愈伤同时用同种条件进行培养，其单宁含量的分析。
具体实施方式
[0025]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.VvMYBPro基因在酿酒葡萄赤霞珠愈伤组织细胞工厂高效合成葡萄单宁的应用。2.VvMYBPro基因，其特征在于：其编码序列为：ATGGGGAGAGCTCCATGTTGTGAGAAGATGGGGTTGAAGAAAGGTCCATGGACTCCCGAAGAAGATCAGATTTTGGTCAATTACATCCACCTTTATGGCCATGGAAACTGGAGGGCACTTCCCAAACAAGCTGGCTTATTGAGGTGTGGAAAGAGTTGCAGACTTCGATGGACGAATTATCTGAGGCCGGATATCAAACGGGGAAACTTCACCAGTGAAGAAGAAGAAACCATCATCGAGTTACATGAAAGGCTGGGCAATAGATGGTCAGCGATAGCAGCGAAACTACCGGGGAGGACAGACAATGAGATAAAAAATGTGTGGCACACCCACTTGAAGAAGAGGCTCAAGCACAACCACGCCACGCCACCCCCTAAAAGACACTCTCTTGATGCGTCCCAAGTCGAAAAACAACAAAACCCCATTAATTCTGCAACCAATTCGAGATCGGAGAGCCTTGGGTATGGACCAGTACTGTCCCCACAGCCGTCCTTTAGCGATATCTCCTCAGCCGCCACCACCACGACCACCACGACCACCGCCACCATGTCCGACATTACTACACCCTGCATTAAGGTCGATTCACCGGAGGATTTCCCAGAAATGGACGAGAATTTCTGGTCGGAAGTACTGTCATCCAAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈可钦，房玉林，张克坤，张诗浩，董洁，孙嘉华，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：