敌草快和百草枯胶体金免疫层析联检卡、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了现场快速检测领域的敌草快和百草枯胶体金免疫层析联检卡、制备方法及应用,所述联检卡包括PCV底板，PCV底板沿层析方向依次设有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，金标垫吸附有百草枯胶体金标记抗体溶液和敌草快胶体金标记抗体溶液，硝酸纤维素膜沿层析方向设有T1检测线、T2检测线和质控线，T1检测线区域包被有百草枯完全抗原，T2检测线区域包被有敌草快完全抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG。联检卡具有稳定性好、灵敏度高和特异性高的优点，可以对不同基质下的敌草快和百草枯同时检测，敌草快和百草枯检测时独立反应，能够避免检测结果出现假阳性，治疗方式不当影响抢救成功率。救成功率。救成功率。

【技术实现步骤摘要】
敌草快和百草枯胶体金免疫层析联检卡、制备方法及应用


[0001]本专利技术属于现场快速检测领域，具体是敌草快和百草枯胶体金免疫层析联检卡及应用。

技术介绍

[0002]敌草快与百草枯均属于联吡啶类除草剂，成分相近，但敌草快毒性较百草枯低，敌草快成人致死量为6～12g，致死率为20～60％，对机体的损伤作用与剂量呈反相关，百草枯成人致死量为20％水溶液5～15毫升(20～40mg/kg)，致死率高达90％，抢救成功率较低，因其危险性且无解药或特效药，我国自2016年7月开始禁止生产销售和使用，随着我国对百草枯的禁用，敌草快作为百草枯的替代品，在农业生产中应用逐年增多。
[0003]敌草快虽然毒性相较于百草枯毒性低，但其除草效果比百草枯低，且价格高于百草枯，部分不良商家将百草枯混入敌草快配伍或套牌使用，百草枯和敌草快的结构和理化性质相似，但毒性和靶向器官不同，百草枯的靶器官是肺部，会导致肺纤维化，严重影响呼吸功能，是主要的死亡原因；而敌草快主要会引起人肾脏、心脏以及中枢神经系统的损伤，在误食敌草快百草枯的混合除草剂或者百草枯假冒敌草快的除草剂时，需及时检测以采取相应的抢救手段。
[0004]现有的对百草枯、敌草快的检测方法主要有：气相色谱法、质谱联用法、高效液相色谱法、紫外分光光度法和毛细管泳电法，以上方法虽然能够对草枯、敌草快定量或者定性检测，特异性好。但存在检测繁琐、检测时间长、对检测设备和相关专业人员高度依赖、费用高等缺点，不便于在临床广泛开展。
[0005]如公布号为CN111781199A的专利公开了一种快速检测尿中百草枯、敌草快的方法，包括步骤一、配制不同浓度含百草枯、敌草快的尿液；步骤二、制作比色表；步骤三、试管准备；步骤四、试剂准备；步骤五、待检测尿液与试剂结合；步骤六、观察检测尿液颜色变化。
[0006]该方法利用百草枯、敌草快含有共轭结构且pH值在10以上，形成游离的离子而产生蓝色(百草枯)或者绿色(敌草快)的原理，对百草枯或者敌草快进行检测。由于该方法较为繁琐，且灵敏度较低，且尿液中同时含有浓度相近的百草枯与敌草快时，存在百草枯和敌草快显色相近，容易相互干扰影响检测结果的问题，进而存在抢救手段误用影响抢救成功率的风险，因此，我们提出了敌草快和百草枯胶体金免疫层析联检卡及应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供敌草快和百草枯胶体金免疫层析联检卡、制备方法及应用，实现敌草快和百草枯两种毒性物质同时快速检测，并解决现有技术中百草枯和敌草快浓度相近时，百草枯和敌草快显色相近，容易相互干扰影响检测结果的问题。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：敌草快和百草枯胶体金免疫层析联检卡，包括PCV底板，PCV底板沿层析方向依次设有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，金标垫吸附有百草枯胶体金标记抗体溶液和敌草快胶体金标记抗体溶液，硝酸纤维素膜沿
层析方向设有T1检测线、T2检测线和质控线，T1检测线区域包被有百草枯完全抗原，T2检测线区域包被有敌草快完全抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG。
[0009]本方案的原理及优势如下：
[0010]由于采用的是联检卡形式，具有快速检测的优点，联检卡上同时包被有百草枯完全抗原和敌草快完全抗原能够实现同时检测，从而实现了对百草枯和敌草快的同时快速检测；
[0011]含有百草枯、敌草快或二者混合物中任意一种的样液滴入样品垫，样液经过吸附有百草枯胶体金标记抗体溶液和敌草快胶体金标记抗体溶液的金标垫时，百草枯成分能够与百草枯胶体金标记抗体溶液相互反应，敌草快成分能够与敌草快胶体金标记抗体溶液相互反应，百草枯和敌草快与胶体金标记抗体溶液反应时不会相互影响，在经过T1检测线和T2检测线时，又能够分别与百草枯完全抗原和敌草快完全抗原结合，因此，即便百草枯和敌草快浓度相近，其结合区域和显色区域不同，检测结果也不会相互干扰。
[0012]现有技术中百草枯和敌草快浓度相近时，百草枯和敌草快显色相近，容易相互干扰影响检测结果的问题，而本方案中敌草快和百草枯检测时彼此不受干扰，结果可以精准鉴别，能够避免出现假阳性，导致误用治疗方案影响抢救成功率，因此，本方案相较于现有技术具有更高的灵敏度。
[0013]除此之外，本方案进行检测时无需对样液进行前处理，不仅提高了检测效率，还避免了采用液相检测时，因敌草快的极性大，流动相以及前处理的溶液对敌草快的检测影响大，图谱容易出现双峰，从而影响检测结果的准确性，经过实验测试，本方案中联检卡的检测速度为5
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10min，灵敏度为20ng/ml，检测准确率达97％，与液质等大型仪器对比灵敏度相当、检测结果误差小，但比液质检测速度更快，能够为百草枯、敌草快中毒诊断第一时间提供诊断依据，争取宝贵的抢救时间，提高中毒患者的生存率，适合中毒现场和实验室的快速检测与批量筛查。
[0014]进一步，硝酸纤维素膜沿其长度方向开有三个通槽，通槽底部贯穿硝酸纤维素膜并延伸至PVC底板内，通槽侧壁下方粘接有第一气囊，通槽侧壁中部粘接有保温层，通槽侧壁均滑动配合有框体，三个框体内分别填充有百草枯完全抗原、敌草快完全抗原和羊抗鼠IgG，填充有百草枯完全抗原的框体构成T1检测线，填充有敌草快完全抗原的框体构成T2检测线，填充有羊抗鼠IgG的框体构成质控线，PVC底板顶部靠近样品垫一侧开有缓冲槽，缓冲槽上粘接有第二气囊和PAM吸水膜，第一气囊与第二气囊连通，初始状态下，框体位于通槽侧壁中部，第一气囊和第二气囊呈充盈状态。
[0015]有益效果：
[0016]1.本方案在PCV底板上设置缓冲槽，样液滴入样品垫时，能够暂存一部分样液在缓冲槽及PAM吸水膜中，减缓样液流向金标垫的速度，避免样液流速过快，百草枯成分来不及与百草枯完全抗原结合或敌草快成分来不及与敌草快完全抗原结合，从而影响结果检测的准确性，且PAM吸水膜具有优异的吸水能力，低浓度的样液暂存在缓冲槽时，样液中的水分能够被PAM吸水膜吸附，使得流向金标垫的样液浓度升高，从而使得样液中的百草枯成分能够更为精准的与百草枯完全抗原结合或敌草快成分能够更为精准的与敌草快完全抗原结合，因此，即便样液滴入前百草枯或敌草快浓度较低，经PAM吸水膜吸水浓缩后依然能够检测出样液中是否含有百草枯或敌草快，使得本方案的联检卡具有较高的灵敏度；
[0017]2.在使用联检卡前，将T1检测线、T2检测线和质控线埋藏于通槽内，本方案中保温层可选用相变温度为
‑
20℃
‑
0℃的蓄冷材料，使百草枯完全抗原、敌草快完全抗原和羊抗鼠IgG在保温层的作用下保温，保持其活性和功能，延长联检卡的保质期；
[0018]3.在缓冲槽和PAM吸水膜之间粘接第二气囊，一是可以阻止样液沿缓冲槽渗漏，二是当缓冲槽积蓄样液时，受样液重力作用挤压第二气囊，第二气囊中的气体流向第一气囊，第一气囊膨胀，进而推动框体向上滑动，使T1检测线、T2检测线和质控线露于硝酸纤维素膜表面，便于经过金标垫的样液能够与百草枯完全抗原、敌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.敌草快和百草枯胶体金免疫层析联检卡，其特征在于：包括PCV底板，PCV底板沿层析方向依次设有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，金标垫吸附有百草枯胶体金标记抗体溶液和敌草快胶体金标记抗体溶液，硝酸纤维素膜沿层析方向设有T1检测线、T2检测线和质控线，T1检测线区域包被有百草枯完全抗原，T2检测线区域包被有敌草快完全抗原，质控线包被有羊抗鼠IgG。2.根据权利要求1所述的敌草快和百草枯胶体金免疫层析联检卡，其特征在于：硝酸纤维素膜沿其长度方向开有三个通槽，通槽底部贯穿硝酸纤维素膜并延伸至PVC底板内，通槽侧壁下方粘接有第一气囊，通槽侧壁中部粘接有保温层，通槽侧壁均滑动配合有框体，三个框体内分别填充有百草枯完全抗原、敌草快完全抗原和羊抗鼠IgG，填充有百草枯完全抗原的框体构成T1检测线，填充有敌草快完全抗原的框体构成T2检测线，填充有羊抗鼠IgG的框体构成质控线，PVC底板顶部靠近样品垫一侧开有缓冲槽，缓冲槽上粘接有第二气囊和PAM吸水膜，第一气囊与第二气囊连通，初始状态下，框体位于通槽侧壁中部，第一气囊和第二气囊呈充盈状态。3.敌草快和百草枯胶体金免疫层析联检卡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤a：制备胶体金溶液：以氯金酸和柠檬酸钠为原料制备胶体金溶液；步骤b：制备百草枯和敌草快胶体金标记抗体溶液：取碳酸钾溶液调节步骤a所制胶体金溶液的PH值至8.0
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8.5，百草枯和敌草快单克隆抗体按量分别加入至胶体金溶液中搅拌1h，分别逐滴加入牛血清蛋白搅拌1h，制得体积浓度为0.9
‑
1.1%的标记后的胶体金溶液，标记后的胶体金溶液在转速9500
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10500r/min的条件下离心15min，弃去上清液，沉淀用重悬液复溶，分别制得百草枯胶体金标记抗体溶液和敌草快胶体金标记抗体溶液，置于4
°
C下保存备用；步骤c：制备金标垫；步骤d：硝酸纤维素膜上包被T1检测线、T2检测线和质控线：将百草枯完全抗原、敌草快完全抗原和羊抗鼠IgG分别包被在T1检测线、T2检测线和质控线区域；步骤e：组装敌草快和百草枯胶体金免疫层析联检卡。4.根据权利要求3所述的敌草快和百草枯胶体金免疫层析联检卡的制备方法，其特征在于：步骤a中，制备前采用王水浸泡冲洗玻璃器皿备用，在108
°
C恒温的油浴锅中加入99mL蒸馏水和1mL质量浓度为1%的氯金酸预热，待回流水流至三口瓶时，加入4mL质量浓度为1%的柠檬酸钠继续搅拌加热30min，直至溶液由紫变红，冷却搅拌至室温，制得含有粒径为10
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30nm的胶体金颗粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：许商成，付冠艳，刘永生，段郁，裴雯，张茂林，施丝，冷晓晓，段维霞，刘聪，孙亚培，余沁，王维，李志强，
申请(专利权)人：重庆医药高等专科学校附属第一医院，
类型：发明
国别省市：