烟草JIH1-1基因在制备抗虫烟草品种中的应用及其方法技术

本发明专利技术公开了烟草Jasmonoyl

【技术实现步骤摘要】
烟草JIH1
‑
1基因在制备抗虫烟草品种中的应用及其方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及烟草JIH1基因在制备抗虫烟草品种中的应用，还涉及制备抗虫烟草品种的方法。

技术介绍

[0002]众多农作物都面临着虫害的威胁。为满足实际生产需求，多种人为培育的产量高、品质优良的烟草品种的部分抗性机制与野生型烟草相比被极大削弱导致实际生产中大部分烟草的农田生态系统较为脆弱，极易感染病虫草害。尽管生物防治不会造成环境污染，但是防治害虫所用的性信息素一方面合成较为困难，另一方面性信息素较为特异，往往一种害虫对应一种性信息素，这也极大的限制了它的应用。通过基因工程培育抗虫害植物品种是伴随着分子生物学手段的进步而出现的一种比较理想的防治害虫的措施。近年来，最先出现的是利用Bt毒蛋白制备的抗虫转基因植株，虽然防治害虫的效果较好。但是，随着Bt作物的种植，害虫对Bt耐受性逐年增强。因此，通过基因工程手段失活或调低对应基因来选择和培育抗虫的的品种是防治虫害比较安全和有效的方法。
[0003]在植物防御过程中，植物激素同样发挥着重要的作用。有研究报道，在二倍体烟草中，JA代谢过程中的相关基因JIH1存在的情况下，会阻断JA代谢进程，进而阻碍JA下游防御相关基因的表达，影响植物的防御过程。在该项研究中，研究人员发现，当利用RNA干涉(RNAi)技术对JIH1基因沉默后，与对照相比，其能够显著降低烟草天蛾和棉叶虫的体重。
[0004]目前，实际生产中所用烟草为异源四倍体烟草，该烟草中也存在JIH基因家族，但是烟草JIH同源基因数量众多，哪些基因的功能与对虫害的抗性相关，目前没有相关研究数据。故对烟草JIH基因进行精准定点失活进而获得抗虫烟草育种素材更是未见报道。因此通过基因编辑的方法，在烟草中对NtJIH基因进行敲除，制作抗虫品种的烟草素材，对于烟草抗虫育种和理论研究具有重要意义。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种敲除烟草JIH1
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1基因在制备抗虫烟草品种中的应用；本专利技术的目的之二在于提供烟草JIH1
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1基因的编辑失活载体；本专利技术的目的之三在于提供所述编辑失活载体在制备抗虫烟草品种中的应用，本专利技术的目的之四在于提供一种制备抗虫烟草品种的方法；本专利技术的目的之五在于提供由所述方法制得的抗虫烟草品种。
[0006]一种制备抗虫烟草品种的方法；本专利技术的目的之四在于提供由所述方法制得的抗虫烟草品种。
[0007]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]1、敲除烟草JIH1
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1基因在制备抗虫烟草品种中的应用，所述烟草JIH1
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1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]本专利技术优选的，所述敲除烟草JIH1
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1基因使用CRISPR/Cas9进行基因编辑。
[0010]本专利技术优选的，所述CRISPR/Cas9使用的烟草JIH1
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1基因的sgRNA靶序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]本专利技术优选的，所述sgRNA由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6退火得到。
[0012]2、烟草JIH1
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1基因的编辑失活载体，所述编辑失活载体由JIH1
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1基因设计的sgRNA连入pORE
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Cas9载体Bsa I酶切位点处而得。
[0013]本专利技术优选的，所述sgRNA靶序列如SEQ ID NO.4所示。
[0014]3、所述编辑失活载体在制备抗虫烟草品种中的应用。
[0015]4、一种制备抗虫烟草品种的方法，构建敲除JIH1
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1基因的sgRNA，然后连入pORE
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Cas9载体Bsa I酶切位点处获得编辑失活载体，转化烟草，筛选抗性芽，生根培养，获得T0代转基因植株，自交获得T1代转基因种子，将T1代转基因种子播种在卡那霉素抗性MS培养基中，获得T1代转基因植株，筛选基因敲除突变植株，即得抗虫烟草品种。
[0016]本专利技术优选的，所述sgRNA靶序列如SEQ ID NO.4所示。
[0017]5、由所述方法制得的抗虫烟草品种。
[0018]本专利技术的有益效果在于：本专利技术公开了敲除烟草JIH1
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1基因在制备抗虫烟草品种中的应用，通过设计sgRNA，然后与载体骨架连接形成编辑失活载体，能够靶向编辑JIH1
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1基因失活，获得对昆虫明显抗性的种质资源，对烟草抗虫机制研究有重大意义。
附图说明
[0019]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：
[0020]图1为JIH1
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1的在根(root)、茎(stem)、叶(leaf)和花(flower)中组织表达谱。
[0021]图2为JIH1
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1基因在棉铃虫(Helicoverpa armigera)取食6h(Ha6h)和12h(Ha12h)的表达谱分析。
[0022]图3为JIH1
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1基因编辑构建载体示意图。
[0023]图4为JIH1
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1基因敲除株系突变位点分析。
[0024]图5为JIH1
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1基因编辑失活株系接种棉铃虫后棉铃虫重量的统计(**P<0.01；*P<0.05)。
[0025]图6为JIH1
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1基因编辑失活株系接种棉铃虫后植物胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor)，过氧化氢酶(CAT)和胼胝质(callose)含量的测定(*P<0.05)。
[0026]图7为JIH1
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1基因敲除后的表型观察(A.NtJIH1
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1纯合突变株与野生型烟草的比较；B.NtJIH1
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1纯合突变株与野生型烟草的植株高度及根的长度的比较；C.生长两周后，NtJIH1
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1纯合突变株与野生型烟草的比较；D.生长一个月后，NtJIH1
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1纯合突变株与野生型烟草的比较)。
具体实施方式
[0027]下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0028]实施例1、烟草JIH1
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1基因片段的获得
[0029]取烟草品种红花大金元的基因组DNA为模板，设计克隆烟草JIH1
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1基因的引物，具
体引物如下：
[0030]NtJIH1
‑1‑
fragment
‑
F：5'
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.敲除烟草JIH1
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1基因在制备抗虫烟草品种中的应用，其特征在于：所述烟草JIH1
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1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述敲除烟草JIH1
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1基因使用CRISPR/Cas9进行基因编辑。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述CRISPR/Cas9使用的烟草JIH1
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1基因的sgRNA靶序列如SEQ ID NO.4所示。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述sgRNA由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6退火得到。5.烟草JIH1
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1基因的编辑失活载体，其特征在于：所述编辑失活载体由JIH1
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1基因设计的sgRNA连入pORE
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：王根洪，李跃跃，易美琴，高天科，夏庆友，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：