天然抗菌剂鸭β-防御素9重组蛋白的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种鸭β－防御素９重组蛋白的制备方法。本发明专利技术采用分子生物学技术，从鸭体内克隆到鸭β－防御素（ＡｖＢＤ）９基因，选用合适的表达宿主在体外表达鸭ＡｖＢＤ　９重组蛋白。进一步研究发现，鸭ＡｖＢＤ　９重组蛋白具有广谱抗菌活性和免疫促进作用。采用本发明专利技术的方法得到的重组鸭ＡｖＢＤ　９重组蛋白的有益效果有：１）能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、猪致病性琏球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌；２）对温度和酸碱度有很高的稳定性，在－２０～１００℃处理３０ｍｉｎ或ｐＨ　３～１２条件下处理３０ｍｉｎ，其杀金黄色葡萄球菌活性不变。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种天然抗菌剂鸭β－防御素９重组蛋白的制备方法，其特征在于：　（１）根据已发表的禽β防御素基因序列设计特异性引物，上游引物：５′－ＡＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＣＣＴＴＧＴＴＧＣ－３′，下游引物：５′－ＴＴＡＧＧＡＧＣＴＡＧＧＴＧ ＣＣＣＡＴＴＴＧＣＡＧＣ－３′；　（２）采用ＲＴ－ＰＣＲ方法从鸭肝脏组织中扩增鸭ＡｖＢＤ９基因并克隆到ｐＭＤ－Ｔ载体上，经序列测定得如下基因序列：　ＡＴＧ　ＡＧＡ　ＡＴＣ　ＣＴＴ　ＴＴＣ　ＴＴＣ　ＣＴＴ　ＧＴＴ　ＧＣＴ　ＧＴＴ　 ＣＴＣ　ＴＴＣ　ＴＴＣ　ＣＴＣ　ＴＴＣ　ＣＡＧ　ＧＣＴ　ＧＣＴＣＣＡ　ＧＣＴ　ＴＡＣ　ＡＧＣ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＧＡＣ　ＧＣＴ　ＧＡＣ　ＡＣＣ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＴＧＣ　ＡＧＧ　ＣＡＧ　ＡＧＣ　ＣＡＣＧＧＣ　ＴＣＣ　ＴＧＣ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＧＴＴ　ＧＣＡ　ＴＧＣ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＧＴＴ　ＧＡＣ　ＡＴＴ　ＧＧＧ　ＡＣＣ　ＴＧＣＣＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＴＧＣ　ＴＧＣ　ＡＡＡ　ＴＧＧ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＡＧＣ　ＴＣＣ　ＴＡＡ　（３）根据鸭Ａｖ ＢＤ９基因序列特点，用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切位点将鸭ＡｖＢＤ９基因亚克隆到原核表达载体ｐＧＥＸ－６ｐ－１中，构建重组表达载体ｐＧＥＸ－６ｐ－１－ＡｖＢＤ９，将其转化大肠杆菌ＢＬ２１感受态细胞，Ａｍｐ＋筛选阳性克隆；　（４）含阳性重 组质粒的大肠杆菌ＢＬ２１单个菌落在Ａｍｐ＋ＬＢ培养基中３７℃振荡培养，待ＯＤ值达到０．３－０．５时加入ＩＰＴＧ、终浓度为０．６ｍＭ进行诱导，诱导２－６小时内，每２小时分别采１ｍｌ菌样，并分别于４℃、５０００转离心５分钟，收获细菌沉淀，在沉淀中加入１／１０菌液体积的１×ＳＤＳ凝胶上样缓冲液，煮沸５分钟，冰浴２分钟，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析鉴定，取处理过的杆品１５ｕｌ／孔，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，积层胶浓度为５％，分离胶为１２％，电泳后，经考马斯亮蓝染色，甲醇－冰乙酸脱色液脱色，再通过薄层灰度扫描，确定蛋白质的表达量，获得分子量３０ｋＤ的特异表达带，经蛋白质印迹分析，证明为鸭ＡｖＢＤ９特异蛋白，蛋白质的表达量为３４％；　（５）经亲和层析柱纯化回收鸭ＡｖＢＤ９重组蛋白，并在体外测定鸭ＡｖＢＤ９重组蛋白的抗菌作 用与理化特性，研究发现鸭ＡｖＢＤ９重组蛋白：１）能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、猪致病性琏球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马得莹，廖文燕，刘胜旺，韩宗玺，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]