天然抗菌剂鸭β-防御素2重组蛋白的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种天然抗菌剂鸭β－防御素２重组蛋白的制备方法。本发明专利技术用分子生物学技术，从鸭体内克隆到鸭β－防御素（ＡｖＢＤ）２基因，选用合适的表达宿主在体外表达鸭ＡｖＢＤ２重组蛋白。进一步研究发现，鸭ＡｖＢＤ　２重组蛋白具有广谱抗菌活性和免疫促进作用。采用本发明专利技术的方法得到的重组鸭ＡｖＢＤ　２重组蛋白的有益效果有：１）能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌；２）对温度和酸碱度有很高的稳定性，在－２０～１００℃处理３０ｍｉｎ或ｐＨ　３～１２条件下处理３０ｍｉｎ，其杀菌活性不变。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种大然抗菌剂鸭β－防御素２重组蛋白的制备方法，其特征在于：　（１）根据已发表的禽β防御素基因序列设计特异性引物，上游引物：５｀－ＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡ－３｀，下游引物：５｀－ＣＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣ－３｀； 　（２）采用ＲＴ－ＰＣＲ方法从鸭胰腺组织中扩增鸭ＡｖＢＤ２基因并克隆到ｐＭＤ－Ｔ载体上，经序列测定得如下基因序列：　ａｔｇａｇｇａｔｃｃ　ｔｔｔａｃｃｔｇｃｔ　ｃｔｔｃｔｃｔｇｔｃ　ｃｔｔｔｔｃｃｔｇｇ　ｔｇｃｔｃｃａｇｇｔ　ｔ ｔｃｔｃｃａｇｇａ　ｔｔｇｔｃｔｔｔｇｃ　ｃｃｃａｇｃｇｇｇａ　ｃａｔｇｔｔｔｃｔｃｔｇｔａｇｇａａａｇ　ｇｃｔｃｃｔｇｃｃａ　ｃｔｔｃｇｇａａｇａ　ｔｇｔｃｃｃａｔｃｃ　ａｃｃｔｇａｔｃａｇ　ａｇｔｔｇｇａａｇｃ　ｔｇｃｔｔｔｇｇｇｔ　ｔｃｃｇｃｔｃｃｔｇ　ｃｔｇｃａａａｔｃｇｃｃａｔｇｇｇａｔｇ　ｔａｔａａ　（３）根据鸭ＡｖＢＤ２基因序列特点，用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切位点将鸭ＡｖＢＤ２基因亚克隆到原核表达载体ｐＧＥＸ－６ｐ－１中，构建重组表达载体ｐＧＥＸ－６ｐ－ １－ＡｖＢＤ２，将其转化大肠杆菌ＢＬ２１感受态细胞，Ａｍｐ＋筛选阳性克隆；　（４）含阳性重组质粒的大肠杆菌ＢＬ２１单个菌落在Ａｍｐ＋ＬＢ培养基中３７℃振荡培养，待ＯＤ值达到０．３－０．５时加入ＩＰＴＧ、终浓度为０．６ｍＭ进行诱导，诱导 ２－７小时内，每小时分别采１ｍｌ菌样，并分别于４℃、５０００转离心５分钟，收获细菌沉淀，在沉淀中加入１／１０菌液体积的１×ＳＤＳ凝胶上样缓冲液，煮沸５分钟，冰浴２分钟，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析鉴定，取处理过的样品１５ｕｌ／孔，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，积层胶浓度为５％，分离胶为１２％，电泳后，经考马斯亮蓝染色，甲醇－冰乙酸脱色液脱色，再通过薄层灰度扫描，确定蛋白质的表达量，获得分子量３０ｋＤ的特异表达带，经蛋白质印迹分析，证明为鸭ＡｖＢＤ２特异蛋白，蛋白质的表达量为３８％；　　（５）经亲和层析柱纯化回收鸭ＡｖＢＤ２重组蛋白，并在体外测定鸭ＡｖＢＤ２重组蛋白的抗菌作用与理化特性，研究发现鸭ＡｖＢＤ２重组蛋白：１）能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌；２）对温度和酸碱度有很 高的稳定性，在－２０～１００℃处理３０ｍｉｎ或ｐＨ　３～１２条件下处理３０ｍｉｎ，其杀菌活性不变。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马得莹，王瑞琴，刘胜旺，廖文燕，韩宗玺，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]