一种改善杨树性状的方法技术

本发明专利技术公开了一种改善杨树性状的方法，通过CRISPR/Cas9系统，敲除杨树GLR3.3a基因和杨树GLR3.3b基因，得到基因敲除杨树。相对于野生型，基因敲除杨树茎细胞壁内出现胶质层，茎中木质部、形成层和皮质宽度增加，纤维素含量显著提高，使木材具有更高的强度和抗拉强度，改进杨树力学性能。进杨树力学性能。进杨树力学性能。

【技术实现步骤摘要】
一种改善杨树性状的方法


[0001]本专利技术属于植物遗传学领域，涉及一种改善杨树性状的方法。

技术介绍

[0002]杨树(拉丁语学名：Populus L.)是杨属的植物，全属有约100多种，全世界约62种(包括6杂交种)，其中分布中国的有57种，引入栽培的约4种，此外还有很多变种、变型和引种的品系。杨树(Populus)分类系统共分为五大派：青杨派(Tacamahaca)、白杨派(Leuce)、黑杨派(Aigeiros)、胡杨派(Turanga)、大叶杨派(Leucoides)。树干通常端直；树皮光滑或纵裂，常为灰白色。主要分布于华中、华北、西北、东北等广阔地区。
[0003]由于繁殖快，生长旺盛，杨树是防风固沙中的重要树种。在用于防风固沙中，希望具有更发达的根系以便更好地固定水土，更好地吸收沙土中的养分。植株变矮能够降低在沙漠或松软土质中杨树被大风吹倒。杨树根系发达也能够更好地在滩涂河边固定土壤，防止水土流失。现有技术中缺少良好的增加根系发达程度且降低植株高度的杨树育种方法，这样的育种将具有推广应用价值。杨树是我国重要的速生工业用材树种和绿化造林树种，根中木质部增多，可更好的运输水分和无机盐。根中木质部的形成和发育直接影响到林木的木材质量和产量，因此有关木质部形成和发育的研究也一直是林木育种的研究的重点，但是由于木质部形成和发育的机理十分复杂，到目前为止，在杨树中尚未见到显著促进根木质部发育的报道。
[0004]杨树木质部是木材利用的主要器官，木质部加宽有利于提高木质素与纤维素的含量，纤维素含量越高，杨树木材的韧性与纤维性越强，更有利于提高杨树木材品质，提高木材的利用率。韧皮部宽度减少促进韧皮纤维长度增加，促进扩大杨树木材的利用范围，利用其优越的力学性能和环保特性可在建筑、船舶及航天材料制作中更好地使用。G
‑
layer(gelatinous layer，胶质层)使木材具有较高含量的胶质纤维和较低含量的木质素，促进木材纤维素含量提高，使木材具有更高的强度和抗拉强度。韧皮部与木质部的生长发育直接影响木材的品质与产量。利用现代生物技术深入了解杨树木材形成过程的关键基因及其调控网络，有助于为阐释树木的生长规律和木材形成机制提供重要的理论支持。利用基因工程技术培育速生优质林木是解决我国木材需求的有效途径，而阐明木材形成的分子机制是遗传改良林木的重要基础。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中存在的不足，本专利技术提供了如下六方面的技术方案。
[0006]本专利技术第一方面提供了一种用于通过CRISPR/Cas9系统敲除杨树基因的gRNA，所述gRNA为第一gRNA，第二gRNA或第三gRNA；
[0007]所述第一gRNA用于敲除杨树GLR3.3a基因；
[0008]所述第二gRNA用于敲除杨树GLR3.3b基因；
[0009]所述第三gRNA用于双敲除杨树GLR3.3a基因和杨树GLR3.3b基因。
[0010]在一些实施方式中，所述杨树为84K杨。
[0011]在一些实施方式中，所述杨树GLR3.3a基因的编码序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示；所述杨树GLR3.3b基因的编码序列如SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示。
[0012]在一些实施方式中，所述第一gRNA的靶序列选自SEQ ID NO:9所示的序列、SEQ ID NO:10所示的序列、SEQ ID NO:12所示的序列、SEQ ID NO:13所示的序列、SEQ ID NO:14所示的序列或其组合；
[0013]所述第二gRNA的靶序列选自SEQ ID NO:15所示的序列、SEQ ID NO:16所示的序列、SEQ ID NO:17所示的序列、SEQ ID NO:18所示的序列、SEQ ID NO:19所示的序列或其组合；
[0014]所述第三gRNA的靶序列包括第一组第三gRNA的靶序列和/或第二组第三gRNA的靶序列；
[0015]所述第一组第三gRNA的靶序列选自SEQ ID NO:20所示的序列、SEQ ID NO:21所示的序列、SEQ ID NO:22所示的序列、SEQ ID NO:23所示的序列、SEQ ID NO:24所示的序列或其组合；
[0016]所述第二组第三gRNA的靶序列为所述第一gRNA的靶序列与所述第二gRNA的靶序列的组合。
[0017]在一些实施方式中，所述第一gRNA的靶序列为SEQ ID NO:9所示的序列和SEQ ID NO:10所示的序列；
[0018]所述第二gRNA的靶序列为SEQ ID NO:15所示的序列和SEQ ID NO:16所示的序列；
[0019]所述第一组第三gRNA的靶序列为SEQ ID NO:20所示的序列和SEQ ID NO:21所示的序列。
[0020]本专利技术第二方面提供了一种基因工程载体，所述基因工程载体能够表达本专利技术第一方面所述的gRNA。
[0021]在一些实施方式中，所述基因工程载体还能够表达Cas9基因。
[0022]本专利技术第三方面提供了一种重组农杆菌，所述重组农杆菌中含有本专利技术第二方面所述的基因工程载体。
[0023]在一些实施方式中，所述重组农杆菌的宿主菌为GV3101或EHA105。
[0024]本专利技术第四方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有本专利技术第一方面所述的gRNA，本专利技术第二方面所述的基因工程载体，或本专利技术第三方面所述的重组农杆菌。
[0025]本专利技术第五方面提供了一种杨树的基因敲除方法，所述基因敲除方法为：
[0026]M1：敲除杨树GLR3.3a基因；
[0027]M2：敲除杨树GLR3.3b基因；
[0028]M3：同时敲除杨树GLR3.3a基因和杨树GLR3.3b基因；或
[0029]M4：相继敲除杨树GLR3.3a基因和杨树GLR3.3b基因中的一种和另一种。
[0030]在一些实施方式中，所述杨树为84K杨。
[0031]在一些实施方式中，所述杨树GLR3.3a基因的编码序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示；所述杨树GLR3.3b基因的编码序列如SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示。
[0032]在一些实施方式中，所述基因敲除是通过CRISPR/Cas9系统实现的。
[0033]在一些实施方式中，使用本专利技术第一方面所述的gRNA进行所述基因敲除。
[0034]在一些实施方式中，所述基因敲除的步骤为：
[0035]S1：制备杨树外植体；
[0036]S2：用农杆菌侵染所述杨树外植体，所述农杆菌能够表达本专利技术第一方面所述的gRNA和Cas9基因。
[0037]S3：共培养经过农杆菌侵染的所述杨树外植体；
[0038]S4：筛选培养经共培养得到的所述杨树外植体得到愈伤组织；
[0039]S5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于通过CRISPR/Cas9系统敲除杨树基因的gRNA，所述gRNA为第一gRNA，第二gRNA或第三gRNA；所述第一gRNA用于敲除杨树GLR3.3a基因；所述第二gRNA用于敲除杨树GLR3.3b基因；所述第三gRNA用于双敲除杨树GLR3.3a基因和杨树GLR3.3b基因。2.如权利要求1所述的gRNA，其特征在于，所述杨树为84K杨；优选地，所述杨树GLR3.3a基因的编码序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示；所述杨树GLR3.3b基因的编码序列如SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示；优选地，所述第一gRNA的靶序列选自SEQ ID NO:9所示的序列、SEQ ID NO:10所示的序列、SEQ ID NO:12所示的序列、SEQ ID NO:13所示的序列、SEQ ID NO:14所示的序列或其组合；所述第二gRNA的靶序列选自SEQ ID NO:15所示的序列、SEQ ID NO:16所示的序列、SEQ ID NO:17所示的序列、SEQ ID NO:18所示的序列、SEQ ID NO:19所示的序列或其组合；所述第三gRNA的靶序列包括第一组第三gRNA的靶序列和/或第二组第三gRNA的靶序列；所述第一组第三gRNA的靶序列选自SEQ ID NO:20所示的序列、SEQ ID NO:21所示的序列、SEQ ID NO:22所示的序列、SEQ ID NO:23所示的序列、SEQ ID NO:24所示的序列或其组合；所述第二组第三gRNA的靶序列为所述第一gRNA的靶序列与所述第二gRNA的靶序列的组合；优选地，所述第一gRNA的靶序列为SEQ ID NO:9所示的序列和SEQ ID NO:10所示的序列；所述第二gRNA的靶序列为SEQ ID NO:15所示的序列和SEQ ID NO:16所示的序列；所述第一组第三gRNA的靶序列为SEQ ID NO:20所示的序列和SEQ ID NO:21所示的序列。3.一种基因工程载体，所述基因工程载体能够表达权利要求1或2所述的gRNA。4.如权利要求3所述的基因工程载体，其特征在于，所述基因工程载体还能够表达Cas9基因。5.一种重组农杆菌，所述重组农杆菌中含有权利要求3或4所述的基因工程载体；优选地，所述重组农杆菌的宿主菌为GV3101或EHA105。6.一种试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1或2所述的gRNA，权利要求3或4所述的基因工程载体，或权利要求5所述的重组农杆菌。7.一种杨树的基因敲除方法，所述基因敲除方法为：M1：敲除杨树GLR3.3a基因；M2：敲除杨树GLR3.3b基因；M3：同时敲除杨树GLR3.3a基因和杨树GLR3.3b基因；或M4：相继敲除杨树GLR3.3a基因和杨树GLR3.3b基因中的一种和另一种。8.如权利要求7所述的基因敲除方法，其特征在于，所述杨树为84K杨；优选地，所述杨树GLR3.3a基因的编码序列如SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示；所
述杨树GLR3.3b基因的编码序列如SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示；优选地，所述基因敲除是通过CRISPR/Cas9系统实现的；优选地，使用权利要求1或2所述的gRNA进行所述基因敲除；优选地，所述基因敲除的步骤为：S1：制备杨树外植体；S2：用农杆菌侵染所述杨树外植体，所述农杆菌能够表达权利要求1或2所述的gRNA和Cas9基因；S3：共培养经过农杆菌侵染的所述杨树外植体；S4：筛选培养经共培养得到的所述杨树外植体得到愈伤组织；S5：分化培养所述愈伤组织得到生芽的杨树植株；S6：生根培养所述生芽的杨树植株，得到生根的基因敲除杨树植株；优...

【专利技术属性】
技术研发人员：安轶，卢孟柱，耿娅，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：