DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法技术

本发明专利技术提供了一种DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法，所述构建方法包括使用生物素标记的DNA探针与tRNA中含有第58位m1A修饰的寡核苷酸片段进行退火杂交；其中，所述生物素标记的DNA探针与所述寡核苷酸片段的碱基互补配对；采用S1核酸酶对上述tRNA中未杂交的区域进行消化，获得含有第58位m1A修饰的RNA/DNA杂合体；提取所述含有第58位m1A修饰的RNA/DNA杂合体，并对所述tRNA中第58位m1A修饰进行定量分析。该方法原理直接、操作简便，无需高通量测序，可以直接获得tRNA中第58位m1A修饰的定量信息。A修饰的定量信息。A修饰的定量信息。

【技术实现步骤摘要】
DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法。

技术介绍

[0002]RNA中除了四种正常核苷：腺嘌呤核苷(A)、鸟嘌呤核苷(G)、尿嘧啶核苷(U)、胞嘧啶核苷(C)外，还包含丰富多样的修饰核苷。迄今为止，已在RNA中鉴定出150多种具有重要功能的表观遗传学修饰。腺嘌呤N1位置上发生的甲基化(m1A)是一种重要的腺苷甲基化修饰，广泛存在于mRNA、rRNA和tRNA中。
[0003]tRNA中含有丰富的m1A修饰。哺乳动物tRNA中的m1A主要位于保守TΨC loop环上的第58位，由tRNA甲基转移酶复合物TRMT6/61A催化形成。哺乳动物tRNA第58位的m1A是一种可逆的甲基化修饰，由去甲基化酶ALKBH1、ALKBH3和FTO催化去甲基。tRNA中第58位的m1A对tRNA的稳定性至关重要。ALKBH1介导的tRNA中第58位m1A的去甲基化会影响tRNA
iMet
的稳定性从而影响翻译起始和翻译延伸，揭示了tRNA的可逆甲基化作为转录后基因表达调控的新机制。ALKBH3介导的tRNA中第58位m1A的去甲基化通过产生tRNA衍生的小RNA促进癌症的发展。尽管tRNA中第58位m1A在调控基因表达和癌症发生发展方面有重要功能，但具体生理过程中第58位m1A修饰的动态变化尚不清楚。除了了解tRNA中m1A修饰的位点外，准确定量特定位点的m1A修饰是深入了解其生物学功能的基础。
[0004]因此，有必要开发一种能应用于特定RNA修饰位点的定量分析中，无需高通量测序，无需复杂的计算，具有高灵敏度、高选择性、操作简便的质谱分析方法。

技术实现思路

[0005]为了解决所述技术问题，本专利技术提供了一种DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法，该方法原理直接、操作简便，无需高通量测序，可以直接获得tRNA中第58位m1A修饰的定量信息。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法，所述方法包括：
[0008]使用生物素标记的DNA探针与tRNA中含有第58位m1A修饰的寡核苷酸片段进行退火杂交；其中，所述生物素标记的DNA探针与所述寡核苷酸片段的碱基互补配对；
[0009]采用S1核酸酶对上述tRNA中未杂交的区域进行消化，获得含有第58位m1A修饰的RNA/DNA杂合体；
[0010]提取所述含有第58位m1A修饰的RNA/DNA杂合体，并对所述tRNA中第58位m1A修饰进行定量分析。
[0011]上述技术方案中，所述tRNA为从生物样品组织或细胞中提取的特定类型tRNA(样
品量根据待测tRNA样品中m1A修饰的水平确定)。
[0012]生物素标记的DNA探针中，所述生物素标记在所述DNA探针的5
’
端。
[0013]进一步地，所述退火杂交的反应体系包括45～55mM Tris
‑
HCl(pH 7.0)、3～7mM MgCl2、3～7μM所述生物素标记的DNA探针和3～7μM所述寡核苷酸片段。优选地，所述退火杂交的反应体系包括50mM Tris
‑
Hcl(pH 7.0)、5mM MgCl2、5μM所述生物素标记的DNA探针和5μM所述寡核苷酸片段。
[0014]进一步地，所述采用S1核酸酶的消化反应的条件为：反应温度为22
‑
24℃，反应时间为10
‑
30min。
[0015]进一步地，所述采用S1核酸酶的消化反应体系包括：1
×
S1 Nuclease Buffer、S1核酸酶。
[0016]进一步地，所述提取采用链霉亲和素磁珠提取。
[0017]进一步地，所述定量分析的方法具体包括：
[0018]配置系列浓度的标准品溶液，通过分析物的峰面积比相对于分析物的浓度构建标准曲线；
[0019]将所述含有第58位m1A修饰的RNA/DNA杂合体通过液相色谱
‑
质谱联用技术分析得到的峰面积比带入所述标准工作曲线，得到样品tRNA中第58位m1A修饰的定量结果。
[0020]进一步地，所述定量分析中标准曲线方程为：y＝0.2763x+0.00864，其中x为修饰核苷m1A与正常核苷G的浓度比值，y为通过液相色谱
‑
质谱获得的峰面积比(修饰核苷m1A/正常核苷G)。
[0021]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0022]本专利技术提供的DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法，通过DNA探针杂交结合S1核酸酶消化获得含有第58位m1A修饰的RNA/DNA杂合体，通过质谱分析获得tRNA中第58位m1A修饰的定量信息。
[0023]本专利技术提供的分析方法的实验原理直接，方法简便，无需复杂的实验操作。无需高通量测序，简化了分析流程，缩短了实验周期。采用质谱作为检测手段，增加了方法的灵敏度，利于低浓度m1A修饰的分析。不涉及复杂的计算，利于tRNA中第58位m1A修饰的定量分析。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0025]图1为本专利技术提出的DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法示意图。
[0026]图2为本专利技术中使用的HEK293T细胞tRNA
Gly(GCC)
结构序列图和DNA探针杂交示意图。
[0027]图3为本专利技术中提取的含有第58位m1A修饰的22
‑
bp RNA/DNA杂合体的凝胶电泳验证图。
[0028]图4为本专利技术中提取的含有第58位m1A修饰的22
‑
bp RNA/DNA杂合体中m1A修饰的定量结果图；
[0029]图5为本专利技术实施例中定量分析的标准曲线图。
具体实施方式
[0030]下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本专利技术，本专利技术的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本专利技术，而非限制本专利技术。
[0031]在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法，其特征在于，所述方法包括：使用生物素标记的DNA探针与含有第58位m1A修饰的tRNA寡核苷酸片段进行退火杂交；其中，所述生物素标记的DNA探针与所述tRNA寡核苷酸片段的碱基互补配对；采用S1核酸酶对所述tRNA寡核苷酸片段中未杂交的区域进行消化，获得含有第58位m1A修饰的RNA/DNA杂合体；提取所述含有第58位m1A修饰的RNA/DNA杂合体，并对所述tRNA中第58位m1A修饰进行定量分析。2.根据权利要求1所述的DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法，其特征在于，所述退火杂交的反应体系包括45～55mM Tris
‑
HCl、3～7mM MgCl2、3～7μM所述生物素标记的DNA探针和3～7μM所述寡核苷酸片段。3.根据权利要求1所述的DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法，其特征在于，所述采用S1核酸酶的消化反应的条件为：反应温度为22～24℃，反应时间为10～30min。4.根据权利要求1所述的DNA探针杂交结合S1核酸酶消化分析tRNA中第58位m1A修饰的分析方法，其特征在于，所述采用S1核酸酶的消化反应体系包括：1
×
S1 Nuclease Bu...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁必锋，游雪娇，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：