一种水环境病毒高效、快速的富集方法技术

本发明专利技术公开了一种水环境病毒快速而高效的富集方法。由以下步骤组成：（１）向１ｍｌ检测样本中加入病毒纳米免疫磁颗粒悬液２μｌ，吸附２０分钟；（２）在３５℃，磁板吸引２分钟；（３）弃上清后用含体积百分比为０．０５％的吐温－２０的０．００５ｍｏｌ／Ｌ的磷酸盐缓冲液１．０ｍｌ洗涤一次，加入０．１ｍｌ生理盐水制成悬液，即可获得富集的病毒，本发明专利技术可使病毒回收率达７０％以上，回收灵敏度为５０ＰＦＵ／ｍｌ。本发明专利技术涉及的纳米免疫磁颗粒用于富集水环境中的病毒，具有快速、高效、效果稳定的优点。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种水环境病毒高效、快速的富集方法，其特征是包括如下步骤：　　①葡聚糖纳米磁颗粒的制备：　　ａ．将０．５～１．２ｍｏｌ／Ｌ的ＦｅＣｌ↓［３］.６Ｈ↓［２］Ｏ水溶液１０～２０ｍｌ与０．５～２．５ｍｏｌ／Ｌ　ＦｅＣｌ↓［２］.４Ｈ↓［２］Ｏ水溶液２～６ｍｌ混合，在氮气氛围下，滴加至１０～３０ｍｌ的３０～７０％的葡聚糖Ｔ－４０水溶液中，所述葡聚糖Ｔ－４０水溶液的浓度为ｇ／ｍｌ百分比浓度，５０～７０℃，水浴１０～３０分钟，在１５０～５００转／分钟的搅拌下，１０～３０分钟内，向混合液中滴加３～７ｍｏｌ／Ｌ的氨水３５－４５ｍｌ，温度保持５０～７０℃，并始终通氮气，制成悬液；　　ｂ．将悬液用乙酸或稀盐酸调至ｐＨ为６．０－８．０；　　ｃ．将悬液中的聚集体在６００×ｇ下离心１０～２０分钟去除游离的葡聚糖后，经聚丙烯酰胺葡聚糖Ｓ－３００凝胶层析柱过滤获得葡聚糖纳米磁颗粒，其中洗脱平衡液为ｐＨ为６～８的０．００５～０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液，收集的颗粒经冷冻干燥，最后获得的葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为５～１０ｍｇ／ｍｌ；　　ｄ．取葡聚糖纳米磁颗粒悬液０．５～２．０ｍｌ，加入１０～３０ｍｍｏｌ／ＬＮａＩＯ↓［４］水溶液０．２５ｍｌ，１５０转／分钟避光阻氧震荡０．５～１２小时后，加入１～３ｍｏｌ／Ｌ乙二醇的水溶液０．１～０．３ｍｌ终止氧化，用ｐＨ为６～８的０．００５－０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液４℃透析１８～４８小时，去除过量的ＮａＩＯ↓［４］，使葡聚糖纳米磁颗粒悬液的浓度为３～８ｍｇ／ｍｌ；　　②纳米免疫磁性颗粒悬液的制备　　向葡聚糖纳米磁颗粒悬液中加入１０～３０μｇ／ｍｇ葡聚糖纳米磁颗粒量的病毒抗体，混匀后，４℃避光放置６～２４小时，加入０．２～１ｍｏｌ／ＬＮａＢＨ↓［４］水溶液还原１０～６０分钟，加入ＮａＢＨ４的量为０．１～０．５ｍｌ／ｍｌ葡聚糖纳米磁颗粒悬液，多余的抗体用Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－３００凝胶层析柱过滤与结合物分离，制成特定病毒的纳米免疫磁颗粒悬液。③分离、浓集水环境中病毒　　在１ｍｌ检测样本中加入纳米免疫磁颗粒悬液２～２０μｌ，吸附３～２０分钟，在１５～３５℃，磁板吸引２－１０分钟，弃上清后用含体积百分比为０．０５％～０．１％的吐温－２０的０．００５～０．０１ｍｏｌ／Ｌ的磷酸盐缓冲液０．５～１．０ｍｌ洗涤一次，加入０．１ｍｌ生理盐水即可制成浓集的病毒悬液。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：金敏，李君文，王新为，邱志刚，谌志强，王景峰，陈照立，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]