昆虫RPA-LFD检测引物和探针以及检测方法技术

本发明专利技术公开了昆虫RPA

【技术实现步骤摘要】
昆虫RPA
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LFD检测引物和探针以及检测方法


[0001]本专利技术涉及昆虫的检测引物和探针以及检测方法，尤其涉及苹小吉丁RPA
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LFD检测引物和探针以及检测方法，属于苹小吉丁的分子检测领域。

技术介绍

[0002]苹小吉丁Agrilus mali Matsumura(鞘翅目：吉丁甲科)是一种十分重要的枝干害虫，常常在中国北方苹果产区造成严重危害，引起苹果产量下降，带来重大经济损失，并在近年来，于中国新疆伊犁河谷野果林内暴发成灾，导致珍贵野生资源新疆野苹果Malus sieversii(Ledeb.)Roem.大面积死亡。
[0003]目前，在苹小吉丁分子检测方面，主要运用线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因序列(≈650bp)比对分析方法，这种方法虽然成熟，但由于需要专门的仪器设备，同时要求操作人员具备相关的专业知识和使用生物信息学分析软件的能力，仅适应于在实验室条件下开展，无法满足基层一线相关人员调查及快速识别苹小吉丁的实际需求。
[0004]重组酶聚合酶扩增技术(recombinase ploymerase amplication，RPA)是2006年由Piepenburg等专利技术的一种新型恒温(37～42℃)核酸扩增技术[Piepenburg O.,Willams C.H.,Stemple D.L.,et al.DNA detection using recombination proteins[J].
[0005]PLoS Biol,2006,4(7):e204.DOI:10.1371/journal.pbio.0040204.]，该方法既可以扩增DNA也可以扩增RNA，省去了额外的cDNA合成步骤整个过程进行得非常快，一般可在10min内获得可检出水平的扩增产物[孙魁.基于RPA
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LFD的核酸可视化检测技术的建立及应用[D].北京:解放军军事医学科学院,2017]。作为一项新的病原体检测技术，目前RPA
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LFD尚未得到广泛研究。近年来，在人、畜、禽及水产动物上已有RPA
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LFD研究报告，而在实验动物病原体检测方面的研究较少。目前，RPA
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LFD的一个重要技术瓶颈是其引物和探针既没有明确的设计原则，也没有专业的设计软件。研究者通常需要手动设计不同的引物和探针(于灵芝.可视化核酸检测技术RPA
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LFD的研究和应用进展.实验动物与比较医学.Dec.2021,41(6))。
[0006]探针长度以及探针相对于引物的最佳位置并没有固定的设计规则，这导致有很多种可能的组合，无疑会增加该方法中引物和探针合成及筛选的成本。因此，设计得到高特异性和灵敏度的引物和探针需要克服一定的技术障碍，才可使RPA
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LFD检测方法的灵敏度和特异度得到保证。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的之一是提供昆虫RPA
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LFD检测引物和探针；
[0008]本专利技术的目的之二是提供一种昆虫RPA
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LFD检测试剂盒；
[0009]本专利技术的目的之三是提供一种苹小吉丁RPA
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LFD检测方法。
[0010]本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0011]本专利技术首先提供了昆虫RPA
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LFD检测引物和探针，其中，所述的昆虫RPA
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LFD检测
引物和探针选自以下第(1)组或者第(2)组中的中的任何一组检测引物和探针：
[0012]第(1)检测引物和探针：检测引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示，在所述检测引物的下游引物的5
’
端连接有生物素；
[0013]所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；优选的，在探针的5
’
端连接有荧光基团；在探针的3
’
端连接有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，更优选的，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团是C3
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Spacer；将距探针的3
’
端的第15个碱基胞嘧啶用四氢呋喃替换；
[0014]第(2)检测引物和探针：检测引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，在所述检测引物的下游引物的5
’
端连接有生物素；
[0015]所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；优选的，在探针的5
’
端连接有荧光基团；在探针的3
’
端连接有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，更优选的，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团是C3
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Spacer；将距探针的3
’
端的第15个碱基胞嘧啶用四氢呋喃替换。
[0016]本专利技术中所述的探针采用nfo探针。nfo探针位于上下游引物之间，在5
’
末端标记荧光基团，中部标记有四氢呋喃位点，在3
’
末端标记扩增位阻基团。当四氢呋喃位点两侧碱基与目标模板配对时，nfo酶被激活从而切割四氢呋喃位点，扩增位阻基团从探针上被切除，最后形成的扩增产物5
’
端连接荧光基团，3
’
端连接生物素。
[0017]本专利技术的另一方面是提供了昆虫RPA
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LFD检测试剂盒，包括：冻干酶，复水缓冲液，昆虫RPA
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LFD检测上、下游引物和探针，ddH2O醋酸镁和胶体金试纸条；其中，所述的昆虫RPA
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LFD检测引物和探针选自以下第(1)组或者第(2)组中的中的任何一组检测引物和探针：
[0018]第(1)检测引物和探针：检测引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示，在所述检测引物的下游引物的5
’
端连接有生物素；
[0019]所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；优选的，在探针的5
’
端连接有荧光基团；在探针的3
’
端连接有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，更优选的，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团是C3
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Spacer；将距探针的3
’
端的第15个碱基胞嘧啶用四氢呋喃替换；
[0020]第(2)检测引物和探针：检测引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示，在所述检测引物的下游引物的5
’
端连接有生物素；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.昆虫RPA
‑
LFD检测引物和探针，其特征在于，所述的昆虫RPA
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LFD检测引物选自以下第(1)组或第(2)组中的任何一组检测引物：第(1)组检测引物：所述的检测引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；第(2)组检测引物：所述的检测引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。2.根据权利要求1所述的昆虫RPA
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LFD检测引物和探针，其特征在于，在所述检测引物的下游引物的5
’
端连接有生物素；在探针的5
’
端连接有荧光基团；在探针的3
’
端连接有阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团，优选的，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的修饰基团是C3
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Spacer；将距探针的3
’
端的第15个碱基胞嘧啶用四氢呋喃替换。3.权利要求1或2所述的昆虫RPA
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LFD检测引物和探针在检测苹小吉丁中的应用；优选的，所述昆虫是苹小吉丁。4.昆虫RPA
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LFD检测试剂盒，包括：冻干酶，复水缓冲液，昆虫RPA
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LFD检测引物和探针，ddH2O，醋酸镁和胶体金试纸条；其特征在于，所述的昆虫RPA
‑
LFD检测引物选自以下第(1)组或第(2)组中的任何一组检测引物：第(1)组检测引物：所述的检测引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；第(2)组检测引物：所述的检测引物由上游引物和下游引物组成，其中，所述的上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示，所述的下游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.5所示；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚艳霞，李承锦，孙荟荃，林若竹，王小艺，赵文霞，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所国家林业和草原局世界自然遗产保护研究中心，
类型：发明
国别省市：