一种固定化南极假丝酵母脂肪酶B的工艺方法技术

本发明专利技术是一种固定化南极假丝酵母脂肪酶Ｂ的工艺方法。它是以有机溶剂为固定介质，在微水相中实现脂肪酶固定化的方法，包括以下步骤是：１）树脂的预处理；２）固定化酶的制备：将预处理过的树脂加入到反应器中，再加入有机介质，静置后加入酶原溶液，加入量为质量比南极假丝酵母脂肪酶Ｂ∶树脂＝１∶６０～１００密封后放置到恒温水浴摇床中，２５～３５℃，条件下１～３ｈ，然后真空冷冻干燥即得。本发明专利技术制备固定化酶的方法，游离酶用量小，固定化效率高，避免了水相吸附法造成的游离酶的大量浪费，从而降低了固定成本；载体廉价易得；工艺简单，条件温和，对酶活性损失小，酶活回收率可达到８３．３％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于固定化酶领域，特别是一种固定化南极假丝酵母脂肪酶B的工艺方法。
技术介绍
酶的固定化就是通过化学或物理的处理方法，使原来水溶性的酶与固态非水溶性支持物 相结合或被载体包埋。被限定于空间某一区域内的酶有利于提高酶的稳定性并可回收重复利 用，便于连续化生产，因此被广泛采用。经过固定化，酶具有了比原来水溶性酶更多的优点-(1)极易将固定化酶与底物、产物分开；(2)可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续 反应；(3)在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；(4)酶反应过程能够加以严格控制；(5) 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；(6)较游离酶更适合于多酶反应；(7)可以提高 产物的收率，提高产物的质量；(8)酶的使用效率高，成本降低。酶的固定化方法主要有四大类共价结合法、载体交联法、吸附法和包埋法。其中，共 价键合法和载体交联法要求生物分子具有能与基质能发生反应的特殊的官能团，且固定化后 的生物分子的取向是固定的，得到的固定化酶稳定性较高，但是底物与生物分子反应活性点 间的接触受到一定限制，另外，共价键合和化学交联过程所发生的剧烈化学反应往往对生物 分子的存活是极其不利的。包埋法具有实验条件温和、对生物活性单元失活作用小、不易泄 漏及可固定高浓度的生物活性单元等优点，但是酶分子被包埋在基质内部，与底物接触受到 —定的限制，不利于其活性的充分发挥。而吸附法是最早出现的酶固定化方法，主要借助于 酶与载体间的范得华力、氢键和离子键等亲和力联结，包括物理吸附和离子交换吸附。虽然 此方法制备得到的固定化酶中酶分子与载体间结合力较弱，但该法条件温和，酶的构象变化 较小或基本不变，对酶的催化活性影响小，另外载体选择范围十分广泛，固定化操作过程简 单，因此吸附法是经济上最具吸引力的固定化方法，受到国内外广大科研人员的关注。在众多脂肪酶中，CALB(Ca"力A卵far"/c 〃pase B，南极假丝酵母脂肪酶B)的用途 最为广泛，它对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。近几年的研究成果表明，CALB 以及Novozyme435(吸附固定于大孔丙烯酸树脂的CALB)在酯化、水解、转酯、以及其它类型 反应中都显示了较其它脂肪酶更为出色的催化性能。但由于固定化酶Novozyme435价格比较 昂贵，在一定程度上限制了其广泛应用。因此，探求一种操作简单、成本低廉的新型固定化3技术，对拓宽GALB的工业应用范围具有重要意义。吸附法固定化酶主要有四种形式水相吸附、载体涂布、游离沉淀和有机相吸附。目前 使用较多的是水相吸附，即将酶溶解于一定量缓冲液中，与载体在一定温度(25-4(TC)下吸 附一定时间，过滤得到固定化酶。水相吸附存在以下缺点固定过程中使用的酶量大，固定 化效率较低，大部分酶仍存在于缓冲液中不能与载体有效结合，这就提高了固定成本，对自 身成本就较高的酶并不适用。而有机相吸附法是以有机溶剂为介质进行酶的固定化，溶解于 微量缓冲液中的酶不溶于有机相，只能存在于载体周围的水膜内，因而固定化效率很高，避 免了水相吸附法造成的酶的大量流失，是一种在微水相中有效的固定化方法。关于脂肪酶GALB的固定化技术的文献报道包括文献1: Enzyme Microb TechnoI ， 2007， 40(5): 1095-1099以戊二醛作为交联剂，将CALB固定于一种聚丙烯类载体上，所得固定化 酶可在离子液体 、 和 中保持活性，解决了游离酶在以离 子液体作为反应介质时变性的问题；文献2:丄of Supercritical Fluids, 2007， 40(1): 93-100将CALB吸附固定于12种经过不同侧链修饰的硅土载体上，分别以离子液体/正己烷 和离子液体/超临界C02为溶剂，研究了载体性质对固定化酶性能的影响。结果表明，当载体 的非功能烷基链被修饰时，固定化酶水解活性可提高5倍；加入离子液体后，固定化酶活性 降低，但稳定性提高；文献3: Microporous and Mesoporous Mater ials， 2008， 109(1-3): 350-361利用自制的的合成贝得石粘土 (载体中硅和铝的含量比不同)，固定脂肪酶CALB和 BCL，研究了载体中铝含量对吸附固定的酶量的影响。结果表明，相同固定化条件下，GALB 的固定化效果优于BCL;用所得固定化酶催化转酯反应，固定化酶的相对活力随载体中铝含 量的降低而升高，但随着吸附酶量的增加而降低，并且利用^-载体得到的固定化酶催化性能 优于Na+—载体f寻至lj白勺固定化醜；文献4: Microporous and Mesoporous Materials, 2008， 114(1-3): 201-213用实验室自制的载体固定化CALB，研究了载体结构(立方体或多六面体)、 孔特性(孔道状或笼状)、孔网络的连通性及孔大小等参数对固定化酶的影响，为固定化酶 提供了新型有效的载体材料；文献5: Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2007， 47(1-2): 13-20将CALB固定于以辛基基团为功能基团的微孔硅上，研究了固定化过程中低 浓度乙醇存在时，对酶与载体表面的界面交互作用有促进作用，从而使得酶的吸附量提高两 倍。文献6: Catalysis Today, 2005， 104(2-4): 313-317将CALB固定在陶瓷膜上，考察了 离子液体对固定化酶的影响，结果表明，未加离子液体仅通过简单的吸附得到的固定化酶活 性更高。文献7: Journal of Mo I ecu I ar Gata I ys i s B: Enzymatic， 2009， 56(4): 196-201， 合成具有相同化学结构，不同孔径、比表面积、相对体积及不同粒子大小的交联大孔亲水聚 乙烯树脂，采用共价结合法固定化CALB，研究了树脂特性对固定化酶的影响，并与游离及商品酶Novozyme435作了比较，结果表明制得固定化酶的活性较两者都高。以上相关文献 仅仅以CALB作为一种模型酶，考察新型载体固载酶的能力及载体性质或结构特点对固定化的 影响，所用固定化方法涉及到水相吸附、交联和共价结合，这些方法的局限在于水相吸附 法游离酶用量大，且酶与载体结合率较低，大部分游离酶仍存在于上清液中；共价结合与交 联法由于固定化过程中载体与酶的结合依靠化学反应实现，对酶的活性影响较大，因此探求 一种固定化效率高、对酶活性影响小的方法很重要。目前为止，文献中还未见以有机溶剂为 介质对CALB进行固定的相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种操作简单、成本低廉的固定化脂肪酶GALB的方 法，它是以有机溶剂为固定介质，在微水相中实现脂肪酶固定化的方法，该方法所用载体价 廉易得，成本较低而且固定化效率较高。本专利技术解决该技术问题所采用的技术方案是一种固定化南极假丝酵母脂肪酶B的工艺方法，包括以下步骤是1) 树脂的预处理将树脂浸泡在体积百分浓度为95%乙醇中24h，取出后用蒸馏水冲洗 干净；再放入质量百分浓度2y。的NaOH溶液中浸泡4h，取出后用蒸馏水洗至中性；再在质量 百分浓度5XHCL溶液中浸泡4h，蒸馏水洗至中性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化南极假丝酵母脂肪酶Ｂ的工艺方法，其特征为包括以下步骤：　１）树脂的预处理：将树脂浸泡在体积百分浓度为９５％乙醇中２４ｈ，取出后用蒸馏水冲洗干净；再放入质量百分浓度２％的ＮａＯＨ溶液中浸泡４ｈ，取出后用蒸馏水洗至中性；再在质量 百分浓度５％ＨＣＬ溶液中浸泡４ｈ，蒸馏水洗至中性，然后在４０℃下干燥１５ｈ；　所述树脂为：树脂Ｓ－８、ＡＢ－８、ＮＫＡ－９、Ｘ－８、ＮＫＡ或Ｄ４０２０；　２）固定化酶的制备：将上步预处理过的树脂加入到反应器中，再加入有机介质静置 １ｈ，加入量为１２～２０ｍｇ树脂／每ｍＬ有机介质，然后向其中加入酶原溶液，加入量为质量比南极假丝酵母脂肪酶Ｂ∶树脂＝１∶６０～１００，振荡均匀，将反应器密封后放置到恒温水浴摇床中，在温度２５～３５℃，摇床转速１００ｒｐｍ的条件下吸附固定１～３ｈ，然后倾析出有机溶剂，剩余固体真空冷冻干燥２４ｈ即得固定化南极假丝酵母脂肪酶Ｂ；　所述有机介质为异辛烷、庚烷或正己烷。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：高静，孙江娜，
申请(专利权)人：河北工业大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]