一种检测家蚕微粒子病毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测家蚕微粒子病毒的方法，本发明专利技术涉及检测技术领域，通过控制变量法，将三个实验组进行实验，利用控制不同环境下的PH值和离子浓度，检测最终的微粒子虫的数量，验证不同PH值和离子浓度对实验准确性的影响，同时，样本经过提纯后，杂质含量明显降低，利用显微镜对微粒子虫的外观特征进行提取辨别，通过颜色标记，能够在短时间内对微粒子虫进行计数，效率较高。效率较高。效率较高。

【技术实现步骤摘要】
一种检测家蚕微粒子病毒的方法


[0001]本专利技术涉及检测
，具体涉及一种检测家蚕微粒子病毒的方法。

技术介绍

[0002]家蚕微粒子病是由微孢子虫寄生在家蚕而引起的一种传染性蚕病，曾给桑蚕业带来巨大打击。通过对微粒子病的研究，法国微生物学家巴斯德于100多年前提出了母蛾镜选法。此后，对家蚕微粒子病的检验就始终采用这种镜选技术。
[0003]现有技术中，如中国专利号为：CN104945049A的一种灭杀蚕纱中家蚕核型多角体病毒及微粒子孢子的方法，包括以下步骤：A备料：准备以下重量份的组分：鲜蚕沙1000份～1125份，甘蔗滤泥100份～166份，发酵剂2.5份，尿素7.5份；B堆制：先将发酵剂、尿素、甘蔗滤泥混合均匀，形成混合物，在三分之一的混合物上铺一层厚28厘米～32厘米的鲜蚕沙，再将取三分之一的混合物均匀撒在铺好的鲜蚕沙上，依照以上方法再铺垫两层；对蚕沙堆进行淋水，保持所述鲜蚕沙的干燥度为50％～55％；C翻堆：对步骤B获得的蚕沙堆进行翻堆；D发酵：对经过步骤C的蚕沙堆进行高温发酵腐熟19天～22天，即可。本专利技术可以解决现有蚕沙中带病影响蚕茧产量和质量的问题。
[0004]但现有技术中，然而传统的母蛾镜选法存在劳动强度大、工作效率低、检测结果无法复现等缺点，且人眼在长时间作业后容易疲劳，也会对检测结果产生不利影响。同时，由于微粒子病毒体积较小，容易与外界杂质混合，传统的光学显微镜很难直观地观察到微粒子病毒的分布。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种检测家蚕微粒子病毒的方法，包括，包括以下步骤：
[0006]步骤一：取三份同种家蚕蚕子，分别标记为A、B、C，将A、B、C三份样本同时置于恒温箱中，恒温箱温度为26摄氏度，孵化周期为20天，挑选破壳的幼虫，剔除未破壳的虫卵，分别标记为A1、A2和A3；
[0007]步骤二：取三份玻璃培养室，消毒灭菌后，将三份样本置于密封有氧环境，持续投喂桑叶；
[0008]步骤三：在结茧前一周半，将病毒孢子以105/个的剂量添食在桑叶上，给予A1样本食用；将病毒孢子以103/个的剂量添食在桑叶上；给予A2样本食用，将病毒孢子以0个的剂量添食在桑叶上，给予A3样本食用；
[0009]步骤四：将三个样本持续养殖至结茧，随后进行微粒子的纯化；
[0010]步骤五：微孢子虫激活发芽，进行荧光显影标记；
[0011]步骤六：电子显微镜进行图像观察，计算微孢子病毒的数量。
[0012]作为一种优选的实施方式，所述步骤四中，微粒子的纯化方法为：
[0013]步骤a：将A1、A2和A3三份样本蚕蛹用75％乙醇对其表面进行消毒处理，并在研钵
中充分研磨，收集研磨液于10mL离心管；
[0014]步骤b：将研磨液稀释之后，设置离心机500r/min，离心5min，收集上清；
[0015]步骤c：用四层纱布将上清过滤后收集滤液，且将滤液离心3000r/min，离心5min，留沉淀，弃上清；
[0016]步骤d：用灭菌双氧水将沉淀重悬；
[0017]步骤e：将灭菌脱脂棉用水浸泡后压实在10mL注射器内，再将孢子悬液用此注射器过滤，离心3000r/min，离心5min后，弃上清，重复步骤d和e三次；
[0018]步骤f：加入适当双氧水重悬沉淀，即为纯化的孢子悬液。
[0019]作为一种优选的实施方式，所述步骤五中，微孢子虫的激活和发芽是侵染宿主过程的重要环节，浸染宿主时，纯化后的孢子极丝弹出，宿主细胞感染，激活所需的条件主要包括环境pH值，Ca
2+
浓度，孢内渗透压这几个重要的方面；
[0020]微孢子虫的激活需要特异的pH值环境，寄生于鳞翅目昆虫体内的微孢子虫需经一定pH值的离子缓冲液处理才能发芽。
[0021]作为一种优选的实施方式，所述孢子极丝弹出及宿主细胞感染包括以下步骤：
[0022](1)孢子与宿主细胞的黏附；
[0023](2)孢子激活；
[0024](3)孢子内的渗透压升高；
[0025](4)极丝外翻弹出；
[0026](5)孢原质经极管进入到宿主细胞的细胞质中。
[0027]作为一种优选的实施方式，所述步骤五中，荧光显影标记采用KMnO4‑
甲基紫将家蚕微粒子虫标记染色成紫色，绿僵孢子和曲霉孢子则呈紫褐色，花粉颗粒呈淡黄色块状。
[0028]作为一种优选的实施方式，所述步骤六中，微粒子图像具有如下特点：
[0029](1)微粒子的形态为卵圆形，大小为(3.6～3.8)μm
×
(2.0～2.3)μm，在显微镜下呈现出淡绿色，外表光滑，具有很强的折光性；
[0030](2)图像内含有大量形状各异的蚕蛾碎片、蛾毛等杂质，以及绿僵孢子等与微粒子外形相近的孢子；
[0031](3)孢子间存在交叠现象；
[0032](4)由于标本是水浸标本，微粒子存在游动现象，使得微粒子的形态大小发生变化并且使图像的整体效果变得模糊。
[0033]作为一种优选的实施方式，所述家蚕微粒子图像需要进行链码跟踪，对家蚕微粒子图像进行链码跟踪后，需要对微粒子病毒的周长、宽度、高度、面积、伸长度、复杂度和矩形度等7个特征参数进行提取；这些特征参数的计算方法为：
[0034](1)周长
[0035]家蚕微粒子的周长即微孢子边缘轮廓所占的像素数，可用8连通链码法对周长进行计算：
[0036]L＝sqrt(2)*N0+N
e
[0037]式中：N0为奇数链码的像素个数，N
e
为偶数链码的像素个数；
[0038](2)长轴
[0039]家蚕微粒子的长轴是微粒子所在椭圆长轴的像素所占的长度；
[0040](3)短轴
[0041]家蚕微粒子的短轴是指通过家蚕微粒子所在椭圆的中心点且与长轴垂直的直线与家蚕微粒子外边缘相交的线段长度；
[0042](4)面积
[0043]家蚕微粒子的面积是指微粒子包含的所有像素点数的总和；在二值图像中，如果用1来表示微粒子，用0表示背景，则面积就是图像中所有像素值为1的点的个数之和；
[0044](5)伸长度
[0045]伸长度代表微粒子最小外接矩形宽与长的比，说明了微粒子的细长程度，随着家蚕微粒子的形状变得细长其伸长度也将变小；E值为1时的形状是正方形，伸长度反映了微粒子与椭圆的接近程度；其计算公式为：
[0046]E＝min(W,H)/max(W,H)；
[0047](6)复杂度
[0048]复杂度是由面积与周长计算得到的，反映家蚕微粒子与圆的接近程度。当识别的图像部分为圆形时，复杂度为最大值1，其计算公式为
[0049]Z＝L2/A，式中，A为区域面积，L为区域周长；
[0050](7)矩形度
[0051]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测家蚕微粒子病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：取三份同种家蚕蚕子，分别标记为A、B、C，将A、B、C三份样本同时置于恒温箱中，恒温箱温度为26摄氏度，孵化周期为20天，挑选破壳的幼虫，剔除未破壳的虫卵，分别标记为A1、A2和A3；步骤二：取三份玻璃培养室，消毒灭菌后，将三份样本置于密封有氧环境，持续投喂桑叶；步骤三：在结茧前一周半，将病毒孢子以105/个的剂量添食在桑叶上，给予A1样本食用；将病毒孢子以103/个的剂量添食在桑叶上；给予A2样本食用，将病毒孢子以0个的剂量添食在桑叶上，给予A3样本食用；步骤四：将三个样本持续养殖至结茧，随后进行微粒子的纯化；步骤五：微孢子虫激活发芽，进行荧光显影标记；步骤六：电子显微镜进行图像观察，计算微孢子病毒的数量。2.根据权利要求1所述的一种检测家蚕微粒子病毒的方法，其特征在于：所述步骤四中，微粒子的纯化方法为：步骤a：将A1、A2和A3三份样本蚕蛹用75％乙醇对其表面进行消毒处理，并在研钵中充分研磨，收集研磨液于10mL离心管；步骤b：将研磨液稀释之后，设置离心机500r/min，离心5min，收集上清；步骤c：用四层纱布将上清过滤后收集滤液，且将滤液离心3000r/min，离心5min，留沉淀，弃上清；步骤d：用灭菌双氧水将沉淀重悬；步骤e：将灭菌脱脂棉用水浸泡后压实在10mL注射器内，再将孢子悬液用此注射器过滤，离心3000r/min，离心5min后，弃上清，重复步骤d和e三次；步骤f：加入适当双氧水重悬沉淀，即为纯化的孢子悬液。3.根据权利要求2所述的一种检测家蚕微粒子病毒的方法，其特征在于：所述步骤五中，微孢子虫的激活和发芽是侵染宿主过程的重要环节，浸染宿主时，纯化后的孢子极丝弹出，宿主细胞感染，激活所需的条件主要包括环境pH值，Ca
2+
浓度，孢内渗透压这几个重要的方面；微孢子虫的激活需要特异的pH值环境，寄生于鳞翅目昆虫体内的微孢子虫需经一定pH值的离子缓冲液处理才能发芽。4.根据权利要求3所述的一种检测家蚕微粒子病毒的方法，其特征在于：所述孢子极丝弹出及宿主细胞感染包括以下步骤：(1)孢子与宿主细胞的黏附；(2)孢子激活；(3)孢子内的渗透压升高；(4)极丝外翻弹出；(5)孢原质经极管进入到宿主细胞的细胞质中。5.根据权利要求1所述的一种检测家蚕微粒子病毒的方法，其特征在于：所述步骤五中，荧光显影标记采用KMnO4‑
甲基紫将家蚕微粒子虫标记染色成...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏建欢，陆正杰，黄康东，陈梦吉，覃龙伟，陈振烽，韦庆进，张寿彬，
申请(专利权)人：河池学院，
类型：发明
国别省市：