胚胎培养液、其在提高胚胎耐热性方面的应用、建立胚胎培养程序的方法及胚胎培养方法技术

本发明专利技术公开了一种胚胎培养液、其在提高胚胎耐热性方面的应用、建立胚胎培养程序的方法及胚胎培养方法，属于畜牧业技术领域。其技术方案包括一种胚胎培养液，以用于胚胎培养的培养液为基质，还包括胡桃醌，所述胡桃醌的浓度为2.5

【技术实现步骤摘要】
胚胎培养液、其在提高胚胎耐热性方面的应用、建立胚胎培养程序的方法及胚胎培养方法


[0001]本专利技术属于畜牧业
，尤其涉及胚胎培养液、其在提高胚胎耐热性方面的应用、建立胚胎培养程序的方法及胚胎培养方法。

技术介绍

[0002]夏季湿热天气容易使动物产生强烈的热应激反应，造成其生理状态改变，进一步影响其生产性能，尤其是繁殖性能。动物遭受热应激时，受精卵着床率低，因而导致受胎率低流产率高，严重影响畜牧业生产效率。因此，在奶牛育种过程中，热应激抗性成为需要关注的新性状之一。由于产奶量的增加导致代谢产热增加以及全球气候的预期变暖，热应激对动物的影响日益严重。然而，牛良种扩繁和群体改良周期很长，其技术有待于进一步优化和改良。对于公牛来说，性控精液、冻精两项技术最大可能的利用了良种公牛的繁殖潜能。但由于母牛的繁殖周期限制，良种母牛的生产效率低，对其繁殖潜能利用率不高。在这种情况下，活体采卵技术、体外胚胎生产和胚胎移植技术的联合应用可以有效利用母牛的繁殖潜能。因此胚胎的体外培养过程就成为良种选育的关键节点。附植前胚胎可以随着自身生长发育或者环境诱导获得一定的耐热能力附植前胚胎可能本身具有一定的耐热能力，也随着自身的生长发育这种能力得以提高或者体外环境的诱导也可使其获得一定的耐热能力。如果建立一种能够诱导附植前胚胎获得耐热能力的特殊培养程序则可以大大节省选育耐热品种的时间，提高培育的效率，并且可以为生产中预防因热应激造成的早期胚胎死亡提供思路。
[0003]目前早期胚胎发育过程中可经药物作用使得胚胎获得抗应激能力，提高胚胎质量和在热应激条件下的胚胎发育率。如褪黑素，白藜芦醇等抗氧化剂可以显著提高囊胚细胞数，降低细胞凋亡率，提高胚胎质量。小檗碱、黄芩苷、黄芪多糖等中药单体对体外胚胎生长发育和细胞增殖有促进作用。其次，环境条件的改变也可诱导早期胚胎获得耐热能力，且具有一定的剂量依赖性。强烈热应激对早期胚胎有损伤作用，但是温和热应激对囊胚发育率孵化率没有显著影响。
[0004]对小鼠着床前胚胎的研究开始于20世纪50年代，培养微滴的制作方法如今仍被广泛应用。随着培养液配方的不断改进，在适宜的培养条件下，胚胎可以有较高的囊胚率和孵化率；但在热应激条件下，随着温度的升高胚胎的发育率显著降低。因为当温度升高时，胚胎自身会产生一系列反应影响其正常发育；另外，当环境温度升高时，胚胎代谢加快、对营养物质的消耗量增加，因此普通的培养液并不能满足高温环境下胚胎的生长发育。胚胎正常的培养温度为：牛胚胎38
‑
39℃、小鼠胚胎37℃。在正常培养温度下牛胚胎发育至囊胚的百分率是16.88
±
5.41，孵出率是4.32
±
3.48；小鼠胚胎发育至囊胚的百分率是83.55
±
2.53，孵出率是58.15
±
1.74。目前，提高小鼠胚胎耐热性的培养液有TCZB，其优点是可以提高小鼠早期胚胎在41℃热应激条件下的发育率，用TCZB培养的胚胎，其囊胚发育率及孵出率(81.3
±
4.5和76.5
±
7.6)显著高于CZB组(80.2
±
5.4和73.4
±
6.2)，提高小鼠胚胎的热
耐受性；但是TCZB并不能提高39℃培养小鼠胚胎发育至囊胚率及囊胚孵出率。此外，TCZB培养液需要利用原核表达法得到TAT蛋白和小鼠Hsp70的串联表达体
‑
Tat
‑
Hsp70，此法技术要求高，操作复杂，且不易成功。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的不足之处，本专利技术所要解决的技术问题是克服当温度升高时，使用传统的培养液培养胚胎，其发育率以及囊胚孵化率均会随温度升高而降低的技术问题，提出一种可以大幅度提高胚胎受热应激时的发育率和囊胚孵化率的胚胎培养液、其在提高胚胎耐热性方面的应用、建立胚胎培养程序的方法及胚胎培养方法。
[0006]为解决所述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]本专利技术一方面公开一种胚胎培养液，以用于胚胎培养的培养液为基质，还包括胡桃醌，所述胡桃醌的浓度为2.5
‑
7.5μM。
[0008]优选的，当胚胎为牛胚胎时，所述用于胚胎培养的培养液为SOF培养液；所述胚胎为小鼠胚胎时，所述用于胚胎培养的培养液为KSOM培养液；所述牛胚胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得；所述小鼠胚胎来自昆明系小鼠输卵管冲取获得。
[0009]本专利技术还提供一种上述任一技术方案所述的胚胎培养液在提高胚胎耐热性方面的应用。
[0010]优选的，利用包含胡桃醌浓度为2.5
‑
7.5μM的胚胎培养液对刚进入八细胞时期的胚胎培养5
‑
8h，从而影响表观遗传中的H3K27ac调控，进而诱导胚胎获得耐热能力。
[0011]本专利技术另一方面公开了一种建立胚胎培养程序的方法，以上述任一技术方案所述的胚胎培养液作为胚胎培养液，包括的胚胎培养液配置步骤、模型建立步骤、培养程序建立步骤以及验证步骤。
[0012]优选的，所述胚胎培养液配置步骤包括：配置不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液，以及包含梯度浓度胡桃醌的多胡桃醌浓度的胚胎培养液；
[0013]所述模型建立步骤包括：将若干胚胎在不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至八细胞时期；将处于八细胞时期的若干胚胎各转入多胡桃醌浓度的胚胎培养液中进行培养，且设置置于相同胡桃醌浓度的胚胎培养液中的胚胎的培养时间不同；然后将胚胎转入不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至桑椹胚时期，并在桑椹胚时期给予胚胎热刺激后培养直到胚胎发育至囊胚孵化期；记录胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况；
[0014]所述培养程序建立步骤包括：依据所述模型建立步骤获得的不同条件下胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况，确定能够使胚胎获得耐热能力的培养液中胡桃醌的浓度及培养时间，从而建立诱导附植前胚胎获得耐热能力的程序；
[0015]所述验证步骤包括：收集桑椹胚时期的胚胎进行H3K27ac蛋白检测，确定胡桃醌是否对胚胎H3K27ac有影响。
[0016]优选的，当胚胎为牛胚胎时，所述胚胎培养液配置步骤包括：配置SOF培养液和在SOF培养液中添加2.5/5/10μM胡桃醌的诱导耐热培养液，在培养皿中做60μL/滴的培养微滴，覆盖矿物油后置于38.5℃含有5％CO2饱和湿度的培养箱平衡2h以上；
[0017]所述模型建立步骤包括：将体外受精获得的早期牛胚胎移入SOF培养液中，震荡，去除颗粒细胞，再用SOF培养液充分洗涤之后进行培养，在38.5℃含5％CO2的CO2培养箱中培
养，转入SOF培养液中发育至八细胞时期，于八细胞时期在含2.5/5/10μM胡桃醌的诱导耐热培养液中培养5/8h，然后将胚胎转入SOF培养液中培养至桑椹胚时期，每24h换液一次，在桑椹胚时期进行42℃热刺激1
‑
2h，之后在38.5℃下培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胚胎培养液，以用于胚胎培养的培养液为基质，其特征在于，还包括胡桃醌，所述胡桃醌的浓度为2.5
‑
7.5μM。2.根据权利要求1所述的胚胎培养液，其特征在于，当胚胎为牛胚胎时，所述用于胚胎培养的培养液为SOF培养液；所述胚胎为小鼠胚胎时，所述用于胚胎培养的培养液为KSOM培养液；所述牛胚胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得；所述小鼠胚胎来自昆明系小鼠输卵管冲取获得。3.一种权利要求1或2所述的胚胎培养液在提高胚胎耐热性方面的应用。4.根据权利要求3所述的胚胎培养液在提高胚胎耐热性方面的应用，其特征在于，利用包含胡桃醌浓度为2.5
‑
7.5μM的胚胎培养液对刚进入八细胞时期的胚胎培养5
‑
8h，从而影响表观遗传中的H3K27ac调控，进而诱导胚胎获得耐热能力。5.一种建立胚胎培养程序的方法，其特征在于，以权利要求1或2所述的胚胎培养液作为胚胎培养液，包括的胚胎培养液配置步骤、模型建立步骤、培养程序建立步骤以及验证步骤。6.根据权利要求5所述的建立胚胎培养程序的方法，其特征在于，所述胚胎培养液配置步骤包括：配置不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液，以及包含梯度浓度胡桃醌的多胡桃醌浓度的胚胎培养液；所述模型建立步骤包括：将若干胚胎在不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至八细胞时期；将处于八细胞时期的若干胚胎各转入多胡桃醌浓度的胚胎培养液中进行培养，且设置置于相同胡桃醌浓度的胚胎培养液中的胚胎的培养时间不同；然后将胚胎转入不包含所述胡桃醌的常规胚胎培养液中培养至桑椹胚时期，并在桑椹胚时期给予胚胎热刺激后培养直到胚胎发育至囊胚孵化期；记录胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况；所述培养程序建立步骤包括：依据所述模型建立步骤获得的不同条件下胚胎发育到桑椹胚、囊胚和囊胚孵化的情况，确定能够使胚胎获得耐热能力的培养液中胡桃醌的浓度及培养时间，从而建立诱导附植前胚胎获得耐热能力的程序；所述验证步骤包括：收集桑椹胚时期的胚胎进行H3K27ac蛋白检测，确定胡桃醌是否对胚胎H3K27ac有影响。7.根据权利要求6所述的建立胚胎培养程序的方法，其特征在于，当胚胎为牛胚胎时，所述胚胎培养液配置步骤包括：配置SOF培养液和在SOF培养液中添加2.5/5/10μM胡桃醌的诱导耐热培养液，在培养皿中做60μL/滴的培养微滴，覆盖矿物油后置于38.5℃含有5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李华涛，侯明晓，张忠顺，丰艳妮，付开强，刘锡武，高磊，曹荣峰，朱士勇，姜忠玲，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：