膀胱癌甲基化位点标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了膀胱癌甲基化位点标志物及其应用。本发明专利技术筛选出一组膀胱癌DNA甲基化位点标志物，包括cg01362243、cg07351192、cg06829686和cg26595643四个甲基化位点。本发明专利技术还提供了上述位点标志物的筛选方法、检测试剂盒及其用途，以及基于上述位点标志物构建的膀胱癌辅助诊断模型、该模型的构建方法和膀胱癌辅助诊断系统。本发明专利技术通过筛选膀胱癌特异性DNA甲基化位点标志物，并基于筛选出的标志物的甲基化水平构建膀胱癌辅助诊断系统，为膀胱癌的早期诊断和大规模筛查提供了切实有效的技术手段。技术手段。技术手段。

【技术实现步骤摘要】
膀胱癌甲基化位点标志物及其应用


[0001]本专利技术涉及膀胱癌甲基化位点标志物及其应用，具体涉及以尿液甲基化DNA作为生物标志物的膀胱癌诊断试剂盒、膀胱癌辅助诊断模型及该模型的构建方法和辅助诊断系统，属于生物医学诊断


技术介绍

[0002]膀胱癌是发生在膀胱黏膜上的泌尿系统最常见的恶性肿瘤。根据2020年癌症临床统计数据，膀胱癌在总人群中发病率排名第12位，而在男性人群中发病率排名第6位，死亡率排名第9位。临床诊断中膀胱癌分为2种病理类型：70％～75％新发患者被诊断为非肌层浸润性膀胱癌(Non
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muscle invasive bladder cancer，NMIBC)，约25％新发患者被诊断为肌层浸润性膀胱癌(Muscle invasive bladder cancer，MIBC)，其中有5％～10％MIBC患者会发生肿瘤转移。NMIBC包括发病于膀胱上皮黏膜层的Ta期、发病于黏膜下层浸润的T1期和发病于原位的Tis期肿瘤，它们在NMIBC中分别占约70％、20％和10％。膀胱癌早期Ta期患者占据大部分比例，因此对膀胱癌Ta期进行无创精准检测是十分必要的。而在治疗方面，目前针对NMIBC患者采取的一线治疗方案是经尿道膀胱肿瘤切除术(Trans urethral resection of bladder tumor，TURBt)，术后约有70％患者复发，而15％患者向晚期病理进展，因此膀胱癌患者需要长期诊断监控，人均终身治疗费用最高。
[0003]在膀胱癌诊断监控方面，膀胱镜检查是金标准，具有高灵敏度，但是它属于侵入性的有创检测，会引起患者不适，而且检测花费高昂。另外临床有2种尿液无创诊断——尿细胞学检查和UroVysion荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)。尿细胞学检查具有高特异性，但灵敏度很低，只有25％～35％，对于低分级膀胱癌Ta期检测甚至只有4％～15％。而FISH检测的灵敏度稍微高一些，在60％～80％，但同样对低分级膀胱癌的检测灵敏度也很低。因此，目前亟需开发无创有效的膀胱癌分子诊断技术，以降低患者痛苦并提高诊断及治疗监控效果。在无创诊断技术开发中，尿液样本因其与膀胱癌病灶直接接触而具备天然的肿瘤早期检测优势。
[0004]尿液活检是目前主要的肿瘤无创诊断手段，该非侵入性诊断方法通过对尿液中肿瘤DNA分子进行分析以获取有效的诊断信息，而甲基化是液体活检无创诊断的主流分子标志物。DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下改变分子遗传表现。研究发现在许多肿瘤发生早期，抑癌基因甲基化增强，因此DNA甲基化是肿瘤早期检测的优秀生物标记物。以往研究发现某些甲基化基因可以作为膀胱癌候选生物标记物。目前已经有一些研究团队开发了膀胱癌生物标志物检测方法，其中不少是尿液DNA甲基化检测。例如，广州基准医疗开发的utMeMA，通过飞行时间质谱平台检测尿液肿瘤多个DNA甲基化位点，建立基于2个甲基化标志物的诊断模型，该模型在膀胱癌早期检测的灵敏度仅有64.5％。再如广州达健生物科技开发的泌安健，通过qMSP(quantitative methylation
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specific polymerase chain reaction，甲基化特异性荧光定量PCR)技术检测尿液膀胱癌多个DNA甲基化位，仅依据检测位点的PCR delta CT数值阈值进行膀胱癌阳性和阴性判断，
缺乏系统的诊断模型，单个甲基化位点依靠单个阈值判断容易引起误诊和漏诊。这些方法的灵敏度和特异度仍有待提高，尤其是在膀胱癌早期的诊断。另外，基于飞行时间质谱平台(如utMeMA)或者二代高通量测序平台的检测成本较高，且检测结果受不同仪器设备的影响非常大，不适合膀胱癌大规模人群的诊断筛查。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是：针对现有技术中膀胱癌诊断手段和诊断标志物的不足，本专利技术提供一种膀胱癌甲基化位点标志物及其应用，基于本专利技术的膀胱癌甲基化位点标志物制备诊断试剂盒和构建诊断模型，有助于通过无创检测实现临床上膀胱癌的早期诊断和大规模筛查。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的第一方面提供了一种用于检测膀胱癌的DNA甲基化位点标志物，所述甲基化位点标志物选自chr20:45160389、chr3：5137773、chr1：47910843和chr10：118899291中的至少一种；
[0007]其中，所述chr20:45160389的位点编号为cg01362243；
[0008]所述chr3：5137773的位点编号为cg07351192；
[0009]所述chr1：47910843的位点编号为cg06829686；
[0010]所述chr10：118899291的位点编号为cg26595643。
[0011]本专利技术的第二方面提供提供了上述用于检测膀胱癌的DNA甲基化位点标志物或检测其甲基化水平的试剂在制备膀胱癌检测产品中的应用。
[0012]优选地，所述检测产品包括检测试剂盒。
[0013]优选地，所述检测甲基化水平的试剂为通过甲基化特异性荧光定量PCR方法检测所述DNA甲基化位点标志物的甲基化水平所用到的试剂，其中，检测样本为受试者尿液。
[0014]优选地，所述试剂包括检测所述DNA甲基化位点标志物的甲基化检测引物对和探针。
[0015]优选地，所述甲基化检测引物对包括以下引物对中的至少一组：
[0016]用于检测位点cg01362243的引物对，其序列如SEQ ID NO:1～2所示；
[0017]用于检测位点cg07351192的引物对，其序列如SEQ ID NO:3～4所示；
[0018]用于检测位点cg06829686的引物对，其序列SEQ ID NO:5～6所示；
[0019]用于检测位点cg26595643的引物对，其序列如SEQ ID NO:7～8所示；
[0020]和/或，所述甲基化检测探针包括以下探针中的至少一种：
[0021]用于检测位点cg01362243的探针，其序列如SEQ ID NO:11所示；
[0022]用于检测位点cg07351192的探针，其序列如SEQ ID NO:12所示；
[0023]用于检测位点cg06829686的探针，其序列如SEQ ID NO:13所示；
[0024]用于检测位点cg26595643的探针，其序列如SEQ ID NO:14所示。
[0025]优选地，还包括用于检测内参基因GAPDH的引物对，所述引物对的序列如SEQ ID NO:9～10所示；
[0026]和/或，还包括用于检测内参基因GAPDH的探针，所述探针的序列如SEQ ID NO:15所示
[0027]本专利技术的第三方面提供了一种基于上述用于检测膀胱癌的DNA甲基化位点标志物
构建诊断模型的方法，所述诊断模型包括膀本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测膀胱癌的DNA甲基化位点标志物，其特征在于，所述甲基化位点标志物选自chr20:45160389、chr3：5137773、chr1：47910843和chr10：118899291中的至少一种；其中，所述chr20:45160389的位点编号为cg01362243；所述chr3：5137773的位点编号为cg07351192；所述chr1：47910843的位点编号为cg06829686；所述chr10：118899291的位点编号为cg26595643。。2.权利要求1所述的用于检测膀胱癌的DNA甲基化位点标志物或检测其甲基化水平的试剂在制备膀胱癌检测产品中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括检测试剂盒。4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测甲基化水平的试剂为通过甲基化特异性荧光定量PCR方法检测所述DNA甲基化位点标志物的甲基化水平所用到的试剂，其中，检测样本为受试者尿液。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测所述DNA甲基化位点标志物的甲基化检测引物对和探针。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述甲基化检测引物对包括以下引物对中的至少一组：用于检测位点cg01362243的引物对，其序列如SEQ ID NO:1～2所示；用于检测位点cg07351192的引物对，其序列如SEQ ID NO:3～4所示；用于检测位点cg06829686的引物对，其序列SEQ ID NO:5～6所示；用于检测位点cg26595643的引物对，其序列如SEQ ID NO:7～8所示；和/或，所述甲基化检测探针包括以下探针中的至少一种：用于检测位点cg01362243的探针，其序列如SEQ ID NO:11所示；用于检测位点cg07351192的探针，其序列如SEQ ID NO:12所示；用于检测位点cg06829686的探针，其序列如SEQ ID NO:13所示；用于检测位点cg26595643的探针，其序列如SEQ ID NO:14所示。7.如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛蔚，曹明，杨国良，曹炀，陈海戈，金迪，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：