分流通道的分区式多重CRISPR核酸检测芯片和方法技术

本发明专利技术公开了一种分流通道的分区式多重CRISPR核酸检测芯片和方法。加样腔加入容纳待测样本溶液，上端有通外界的加样口；核酸扩增腔在加样腔下方且内有核酸扩增试剂；多个CRISPR检测腔并联用于多个基因检测，经液体通道与核酸扩增腔汇合连通；CRISPR检测腔经毛细管阀和加样口连通，加样腔、核酸扩增腔、CRISPR检测腔之间、加样腔间通过环形流道连通。本发明专利技术可快速有效地实现多种核酸在一个反应体系中同时扩增，仅一次扩增实现多个基因在一扩增腔中同步扩增，并利用多重多个基因一体化集成检测，互不干扰，简化了多种核酸检测的操作和流程并提升了检测结果准确度，避免了大量的移液和混匀操作，省时省力。省时省力。省时省力。

【技术实现步骤摘要】
分流通道的分区式多重CRISPR核酸检测芯片和方法


[0001]本专利技术是属于微生物学和生化分析领域的一种CRISPR核酸检测芯片和方法，主要涉及到一种利用多重CRISPR对一个反应体系中的多种核酸扩增产物进行一体化集成检测的芯片和方法。

技术介绍

[0002]核酸扩增技术可以让DNA在几十分钟，甚至短短数分钟内实现指数级的大量复制，具有核酸信号放大功能。除了传统的聚合酶链式扩增(PCR)，兴起的环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等等温扩增技术因其更易实现的扩增条件，越来越多地用于核酸检测。生化、食品、环境、医疗等样本中待测核酸的含量一般不高，难于直接检测，通常在检测之前先进行核酸扩增。再利用嵌入式荧光染料或荧光探针的荧光信号检测核酸。但是嵌入式荧光染料是一种非模板依赖的检测方法，特异性不高，容易导致假阳性结果；而荧光探针需要根据靶序列来合成，不同的靶序列需要合成不同的荧光探针，且合成成本较高。
[0003]CRISPR新型分子检测技术是基于CRISPR/Cas系统独特的反式切割能力。如Cas12a蛋白、Cas12b蛋白、Cas13a蛋白、Cas14蛋白等CRISPR结合蛋白能够非特异性地切割体系中任意的单链DNA。利用该原理，在核酸扩增的基础上，在体系中添加荧光报告分子。当CRISPR/Cas系统识别靶序列时，会切割报告分子，随后对报告分子产生的荧光信号进行测定，即可确定样本中靶基因是否存在。gRNA可精准定位目标基因位点，Cas蛋白在目标位点进行精确剪切。CRISPR/Cas系统的精确识别给检测带来了高特异性，持续的剪切给检测带来了高灵敏度，且温和的反应温度，降低了对检测设备和环境的要求，使得CRISPR检测技术在核酸检测中显示出巨大的潜力。
[0004]传统的单重CRISPR每次只能检测一个靶基因。当需要检测同一样本中的多个基因时，一次次的单重检测需要耗费大量的人力物力，因此出现了多重CRISPR检测技术。一管式多重CRISPR检测通常是将多个靶基因对应的引物和gRNA同时加入扩增和检测体系中，实现多个基因的同时扩增和检测。然而，由于核酸扩增和CRISPR检测的试剂和反应温度不兼容，并且某个基因或其引物的存在可能会影响其他基因的检测，使得多重CRISPR检测的发展受到限制。

技术实现思路

[0005]为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提出了一种利用分流通道的分区式一体化多重CRISPR核酸检测芯片和方法，可快速有效地实现多种核酸在一个反应体系中同时扩增并利用多重CRISPR对扩增产物中的多个基因进行一体化集成检测。该芯片和方法避免了气溶胶释放到周围环境中，同时解决了扩增与检测过程中试剂、反应温度不兼容的问题。此外，还简化了多种核酸检测的操作和流程并提升了检测结果准确度。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]所述芯片内部沿环形顺时针或者逆时针的流通顺序依次设置一个加样腔、一个核酸扩增腔、一个混合腔、两个或两个以上CRISPR检测腔，还设置和CRISPR检测腔相同数量的毛细管阀，以及将这些腔相连的通道，具体介绍如下：
[0008]包括一个加样腔，用于加入、容纳待测样本溶液，加样腔上端有一个与外界相通的开口作为加样口，待测样本溶液从加样口加入；
[0009]包括一个核酸扩增腔，位于加样腔下方，用于待测样本溶液进行核酸扩增反应形成核酸扩增产物，核酸扩增腔内预先置有预先包埋或冻干的核酸扩增试剂；
[0010]包括两个或两个以上并联的CRISPR检测腔，用于核酸扩增产物中两个或两个以上基因检测，即需要检测几个基因就设置几个CRISPR检测腔。CRISPR检测腔预先内置有预先包埋或冻干的目的基因CRISPR检测试剂；若干个CRISPR检测腔并行排布，通过各自的液体通道与前面的核酸扩增腔/混合腔汇合连通；
[0011]具体实施中，CRISPR检测腔位于混合腔右上方，通过液体通道与混合腔连通，腔内有预先包埋或冻干的CRISPR检测试剂(包括buffer、RNA酶抑制剂、Cas蛋白、DNA探针、基因特异性的crRNA等)。
[0012]包括与CRISPR检测腔数量一致的毛细管阀，每个CRISPR检测腔均经一个毛细管阀和加样腔的加样口连通，位于并连接到每个CRISPR检测腔面向核酸扩增腔的相反一侧；在核酸扩增产物进入CRISPR检测腔之前作用是通气，在核酸扩增产物进入CRISPR检测腔之后作用是截留住腔内的核酸扩增产物，使混匀后的核酸扩增产物的溶液留在CRISPR检测腔，直至溶液进入各CRISPR检测腔；
[0013]加样腔和核酸扩增腔之间、核酸扩增腔和CRISPR检测腔之间、CRISPR检测腔和加样腔的加样口之间均通过芯片内部的环形流道连通，构成一个位于芯片内部的近似周向环形循环流通过程，这样的设计使芯片内部气压自动平衡，液体流动可利用重力和旋转动作实现，无需任何外界的泵、阀，待测样本溶液通过旋转芯片在重力的作用下依次流经核酸扩增腔和各个CRISPR检测腔，完成不同基因一体快捷迅速的CRISPR核酸检测。
[0014]芯片内部的流道均连通到核酸扩增腔和CRISPR检测腔的径向内侧，即核酸扩增腔和CRISPR检测腔均位于芯片内部的流道的外侧或者靠外侧。
[0015]所述芯片还可包括一个较大体积的混合腔，处于核酸扩增腔和CRISPR检测腔之间，使得核酸扩增腔经混合腔和多个CRISPR检测腔连通，混合腔用于对待测样本溶液经核酸扩增反应后的核酸扩增产物进行混匀，使体系均一，确保进入后续不同CRISPR检测腔的核酸浓度均一，具体实施中混合腔位于加样腔的另一侧，通过液体通道与核酸扩增腔连通；
[0016]这样情况下，若干个CRISPR检测腔并行排布，通过各自的液体通道与前面的混合腔汇合连通。
[0017]加样腔和核酸扩增腔之间、核酸扩增腔和混合腔、混合腔和CRISPR检测腔之间、CRISPR检测腔和加样腔的加样口之间均通过芯片内部的环形流道连通，构成一个位于芯片内部的近似周向环形循环流通，这样的设计使芯片内部气压自动平衡，液体流动可利用重力和旋转动作实现，无需任何外界的泵、阀，待测样本溶液通过旋转芯片在重力的作用下依次流经核酸扩增腔和各个CRISPR检测腔，完成不同基因一体快捷迅速的CRISPR核酸检测。
[0018]芯片内部的流道均连通到核酸扩增腔、混合腔和CRISPR检测腔的径向内侧，即核酸扩增腔、混合腔和CRISPR检测腔均位于芯片内部的流道的外侧或者靠外侧。
[0019]具体实施中，核酸扩增腔和CRISPR检测腔位于芯片内的对侧。
[0020]在核酸扩增腔具有待测样本溶液时，所述的混合腔高于核酸扩增腔中所盛待测样本溶液的液面最高点。
[0021]当扩增结束后，将芯片的基准面垂直于地面逆时针旋转90
°
，在重力作用下，核酸扩增腔中的扩增液及加样腔中残留的液体进入混合腔，并进行混合。为了增强混合效果，可以在混合腔中预置磁珠，利用外加磁场控制磁珠进行搅拌；也可以利用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分流通道的分区式多重CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：所述芯片内部沿顺时针或者逆时针的流通顺序依次设置一个加样腔(2)、一个核酸扩增腔(3)、两个或两个以上CRISPR检测腔(51/52/53)具体如下：包括一个加样腔(2)，用于加入、容纳待测样本溶液，加样腔(2)上端有一个与外界相通的开口作为加样口，待测样本溶液从加样口加入；包括一个核酸扩增腔(3)，位于加样腔(2)下方，用于待测样本溶液进行核酸扩增反应形成核酸扩增产物，核酸扩增腔(3)内预先置有核酸扩增试剂；包括两个或两个以上并联的CRISPR检测腔(51/52/53)，用于核酸扩增产物中两个或两个以上基因检测，CRISPR检测腔预先内置有目的基因CRISPR检测试剂；若干个CRISPR检测腔并行排布，通过各自的液体通道与前面的核酸扩增腔(3)汇合连通；包括与CRISPR检测腔数量一致的毛细管阀(81/82/83)，每个CRISPR检测腔均经一个毛细管阀和加样腔(2)的加样口连通，位于每个CRISPR检测腔面向核酸扩增腔(3)的相反一侧；在核酸扩增产物进入CRISPR检测腔之前作用是通气，在核酸扩增产物进入CRISPR检测腔之后作用是截留住腔内的核酸扩增产物；加样腔(2)和核酸扩增腔(3)之间、核酸扩增腔(3)和CRISPR检测腔之间、CRISPR检测腔和加样腔(2)的加样口之间均通过芯片内部的环形流道连通。2.根据权利要求1所述的一种分流通道的分区式多重CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：所述芯片还包括一个混合腔(4)，处于核酸扩增腔(3)和CRISPR检测腔之间，使得核酸扩增腔(3)经混合腔(4)和多个CRISPR检测腔连通，混合腔(4)用于对核酸扩增产物进行混匀，确保进入后续不同CRISPR检测腔的核酸浓度均一。3.根据权利要求1所述的一种分流通道的分区式多重CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：加样腔(2)和核酸扩增腔(3)之间、核酸扩增腔(3)和混合腔(4)、混合腔(4)和CRISPR检测腔之间、CRISPR检测腔和加样腔(2)的加样口之间均通过芯片内部的环形流道连通，构成一个环形循环流通。4.根据权利要求2所述的一种分流通道的分区式多重CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：在核酸扩增腔(3)具有待测样本溶液时，所述的混合腔(4)高于核酸扩增腔(3)中所盛待测样本溶液的液面最高点。5.根据权利要求3所述的一种分流通道的分区式多重CRISPR核酸检测芯片，其特征在于：所述芯片还包括与CRISPR检测腔、毛细管阀(81/82/83)数量一致的气体通道结构(71/72/73)，每个CRISPR检测腔均经各自的一个毛细管阀(81/82/83)、气体通道结构(71/72/73)后和加样腔(2)的加样口连通，气体通道结构(71/72/73)位于每个CRISPR检测腔面向核酸扩增腔(...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴坚，朱媛媛，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：