一种基于Au@CuZn-ZIF纳米酶探针的化学发光成像免疫检测方法技术

本发明专利技术涉及免疫学分析检测技术领域内一种基于Au@CuZn

【技术实现步骤摘要】
一种基于Au@CuZn
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ZIF纳米酶探针的化学发光成像免疫检测方法


[0001]本专利技术涉及免疫学分析检测技术，具体涉及一种用于检测蛋白质分子的基于Au@CuZn
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ZIF纳米酶的化学发光成像免疫检测方法。

技术介绍

[0002]化学发光（Chemiluminescence）是由基于化学反应过程中提供的能量激发物质所产生的光辐射的分析方法。化学发光成像免疫分析结合了化学发光免疫分析与成像技术，兼具化学发光免疫分析的优点和成像分析通量高的特点，线性范围宽，分析速度快，可用于检测蛋白质、激素、细胞因子等微量物质，在疾病的诊断、检测机体免疫功能状况、监测治疗效果和监测病情中也发挥着重要的作用。
[0003]传统化学发光免疫分析通常采用天然酶（HRP）标记抗体，但是天然酶易失活、难提取且对极端环境耐受性差等缺陷限制了化学发光免疫分析的发展及应用。相比于天然酶，纳米酶作为具有优异类酶催化活性的纳米材料受到广大研究人员的青睐。其中金属离子和有机连接物自组装形成的金属有机骨架（MOF）因具有比表面积大、孔隙率高、稳定性好等优势而被不断开发。将MOF纳米酶引入化学发光体系作为探针用来标记抗体，可有效克服天然酶的局限性，催化过氧化氢生成强氧化性羟基自由基触发鲁米诺产生化学发光信号，并与抗原特异性结合进行检测。
[0004]与单金属配位结构相比，双金属MOF纳米酶具有更好的催化性能和稳定性，一方面，双金属中心的构建可以增加催化中心的数量；另一方面，两个金属中心之间的电位差可以促进电子转移，从而有助于提高催化活性。但在生物相容性和检测敏度上有待进一步提高。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种利用Au@CuZn
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ZIF纳米酶的化学发光成像免疫传感器，以提高金属有机骨架纳米酶的生物相容性和催化活性，并结合三明治夹心法，实现对目标抗原高通量、高特异性、高灵敏度的检测。
[0006]本专利技术的目的是这样实现的，一种基于Au@CuZn
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ZIF纳米酶探针的化学发光成像免疫检测方法，其特征在于，通过如下步骤制备得到：第1步，制备Au@CuZn
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ZIF纳米酶并在其表面修饰羧基，连接二级抗体Ab2制得Au@CuZn
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ZIF
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Ab2纳米酶探针；第2步，将抗原分子和Au@CuZn
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ZIF
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Ab2纳米酶探针滴加到一级抗体Ab1修饰的环氧基活化载体片表面，温育形成三明治夹心的化学发光成像免疫传感器，实现对抗原分子的检查。
[0007]本专利技术的利用Au@CuZn
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ZIF纳米酶的化学发光成像免疫传感器，首先制备Au@CuZn
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ZIF纳米酶，再将Au@CuZn
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ZIF纳米酶应用到化学发光体系，其中铜离子的引入与锌作
为双金属中心协同增强了MOF的类酶催化活性，同时，金纳米颗粒的引入增强了纳米酶的生物相容性可有效固定抗体。可利用Au@CuZn
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ZIF纳米酶替代天然酶标记二级抗体制备纳米酶探针，结合三明治夹心法，收集检测对应的发光信号，通过化学发光信号与抗原浓度之间的线性关系可以实现目标蛋白质分子的准确检测，并可提高检测的灵敏度和特异性。
[0008]为便于制备Au@CuZn
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ZIF
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Ab2纳米酶探针，第一步包括以下分步骤：1.1首先将Zn(NO3)2·
6H2O和Cu(NO3)2·
3H2O溶于甲醇中形成A液，再将2
‑
甲基咪唑溶于甲醇中形成B液，将A液逐滴滴加入B液，常温搅拌反应30
‑
60min，然后离心收集并洗涤混合液中的固相产品，得到CuZn
‑
ZIF纳米粒子；1.2将CuZn
‑
ZIF纳米粒子溶于水形成溶液，加入到嵌段式聚醚 F
‑
127水溶液中，常温搅拌30
‑
60min，加入HAuCl4溶液，再常温搅拌30
‑
60min后加入NaBH4溶液，继续搅拌两个小时，然后离心收集洗涤混合液中的固相产品，得到Au@CuZn
‑
ZIF纳米酶；1.3将Au@CuZn
‑
ZIF纳米酶溶于磷酸缓冲溶液中，加入11
‑
疏基十一烷酸（MUA）溶液以在Au@CuZn
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ZIF表面修饰羧基，接着用1
‑
（3
‑
二甲氨基丙基）
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N
‑
羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合溶液活化羧基，再加入二级抗体（Ab2），4℃下搅拌3 h，然后继续在4℃下离心洗涤，得到Au@CuZn
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ZIF
‑
Ab2纳米酶探针，分散于磷酸缓冲溶液中低温储藏。
[0009]进一步地，1.1分步中，A液中Zn(NO3)2·
6H2O和Cu(NO3)2·
3H2O的浓度分别为0.013 mol/L、0.05 mol/L，所述B液中2
‑
甲基咪唑的浓度为0.55 mol/L ，A液与B液的体积比为1：2。
[0010]进一步地，1.2分步中，CuZn
‑
ZIF溶液的浓度为4 mg/mL，F
‑
127水溶液的浓度为3 mg/mL，HAuCl4溶液的浓度为10 mmol/L，NaBH4溶液的浓度为0.1 mol/L，CuZn
‑
ZIF、F
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127、HAuCl4、NaBH4溶液的体积比为50: 100: 20: 3。
[0011]进一步地，1.3分步中， Au@CuZn
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ZIF溶液的浓度为2 mg/mL，MUA溶液的浓度为0.01 mol/L，EDC和NHS溶液的浓度均为10 mg/mL，二级抗体（Ab2）溶液的浓度为1 mg/mL，Au@CuZn
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ZIF、MUA、EDC、NHS和Ab2溶液的体积比为100: 20: 10: 7: 4。
[0012]为便于利用制备的Au@CuZn
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ZIF
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Ab2纳米酶探针进行发光免疫检测，第2步包括以下分步骤：2.1 利用丝网印刷技术并借助模板在环氧硅烷化的载玻片表面制作反应微孔阵列；2.2 将一级抗体（Ab1）溶液与壳聚糖溶液混合，振荡均匀后滴入反应阵列的微孔中，在4℃下保存12小时；2.3 在微孔表面滴加牛血清白蛋白溶液，于4℃环境中密封温育12小时封闭未结合位点，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗并在室温下晾干；2.4 在微孔表面滴加抗原溶液与一级抗体（Goat anti
‑
HIgG, Ab1）反应，室温温育半个小时，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗并在室温下晾干；2.5 在微孔表面滴加Au@C本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Au@CuZn
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ZIF纳米酶探针的化学发光成像免疫检测方法，其特征在于，通过如下步骤制备得到：第1步，制备Au@CuZn
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ZIF纳米酶并在其表面修饰羧基，连接二级抗体Ab2制得Au@CuZn
‑
ZIF
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Ab2纳米酶探针；第2步，将抗原分子和Au@CuZn
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ZIF
‑
Ab2纳米酶探针滴加到一级抗体Ab1修饰的环氧基活化载体片表面，温育形成三明治夹心的化学发光成像免疫传感器，实现对抗原分子的检查。2.根据权利要求1所述的基于Au@CuZn
‑
ZIF纳米酶探针的化学发光成像免疫检测方法，其特征在于，第一步包括以下分步骤：1.1首先将Zn(NO3)2·
6H2O和Cu(NO3)2·
3H2O溶于甲醇中形成A液，再将2
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甲基咪唑溶于甲醇中形成B液，将A液逐滴滴加入B液，常温搅拌反应30
‑
60min，然后离心收集并洗涤混合液中的固相产品，得到CuZn
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ZIF纳米粒子；1.2将CuZn
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ZIF纳米粒子溶于水形成溶液，加入到嵌段式聚醚 F
‑
127水溶液中，常温搅拌30
‑
60min，加入HAuCl4溶液，再常温搅拌30
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60min后加入NaBH4溶液，继续搅拌两个小时，然后离心收集洗涤混合液中的固相产品，得到Au@CuZn
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ZIF纳米酶；1.3将Au@CuZn
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ZIF纳米酶溶于磷酸缓冲溶液中，加入11
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疏基十一烷酸（MUA）溶液以在Au@CuZn
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ZIF表面修饰羧基，接着用1
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（3
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二甲氨基丙基）
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N
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羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合溶液活化羧基，再加入二级抗体（Rabbit anti
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HIgG, Ab2），4℃下搅拌3 h，然后继续在4℃下离心洗涤，得到Au@CuZn
‑
ZIF
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Ab2纳米酶探针，分散于磷酸缓冲溶液中低温储藏。3.根据权利要求2所述的基于Au@CuZn
‑
ZIF纳米酶探针的化学发光成像免疫检测方法，其特征在于, 1.1分步中，A液中Zn(NO3)2·
6H2O和Cu(NO3)2·
3H2O的浓度分别为0.013 mol/L、0.05 mol/L，所述B液中2
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甲基咪唑的浓度为0.55 mol/L ，A液与B液的体积比为1：2。4.根据权利要求2所述的基于Au@CuZn
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ZIF纳米酶探针的化学发光成像免疫检测方法，其特征在于，1.2分步中，CuZn
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ZIF溶液的浓度为4 mg/mL，F
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127水溶液的浓度为3 mg/mL，HAuCl4溶液的浓度为10 mmol/L，NaBH4...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨占军，姜国敏，李娟，石凤，吉爽爽，孟广宇，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：