羌活组织培养繁殖方法技术

本发明专利技术提供了一种羌活组织培养繁殖方法，以羌活萌发的根芽为外植体，经消毒处理、接种诱导形成愈伤组织后，再经愈伤组织增殖、芽诱导和根诱导，形成完整植株小苗，将完整小苗移栽到育苗基质中，长成正常羌活植株，所用基本培养基均为以ＭＳ培养基为基础，辅以６－糠基腺嘌呤、６－苄基腺嘌呤、２，４－二氯苯氧乙酸、萘乙酸、蔗糖和活性炭等成分；本发明专利技术应用组织培养克服羌活育苗周期太长、繁殖系数低的问题，可进行工厂化快速育苗，以适应市场对羌活的需求。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物的培养和繁殖，特别是一种羌活组织培养繁殖方法。
技术介绍
羌活是伞形科(Umbelliferae)多年生野生药材，是我国的特有植物物种，是中藏羌药中最常用的药材之一。羌活以根状茎及根入药，味辛、性温，有散表寒、祛风湿、利关节等功效，主治感冒风湿、发热头痛、皮肤骚痒、风水浮肿、痈疽疮毒等症。我国历版药典对羌活均有收载，据《中华人民共和国药典》2005年版一部，为伞形科(Umbelliferae)多年生草本植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang和宽叶羌活N.forbesiiBoissieu的干燥根茎及根，开发历史悠久，药材商品有蚕羌、竹节羌、头羌、条羌及羌王。四川是羌活的道地产区，川产羌活以N.incisum为主，销全国并出口，主产甘孜、阿坝、凉山三州等地2700米以上高海拔山区。长期以来，由于其来源完全依赖野生采挖，种质资源破坏严重、蕴藏量急剧减少，尤其是近年来随着国内外对羌活需求量的增加，供需矛盾日益突出，加之利益驱使，大量掠夺性采挖，使羌活逐渐成为濒临植物，面临物种丧失，资源枯竭的危险，进行种质保护和扩大羌活繁育势在必行。植物组织培养技术是利用细胞的全能性(个体的某个器官或组织已经分化的细胞再生成完整个体的遗传潜力。)，取植物个体上的细胞团或组织，通过人工配制的培养基，使这些细胞团或组织形成成千上万个植株。利用组培进行离体快繁在以下三方面有重要意义(1)繁殖速度快，不受气候因素影响，一年四季在室内均可繁殖；(2)便于保持优良种性；(3)在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义，一株具有明显优势的羌活突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推广。其他高山野生药材，如红景天等的组织培养已有文献报道，但野生羌活组织培养尚未见报道。从野外采集的外植体，其表面易滋生细菌和真菌等微生物，有的甚至长到组织内部(内生菌)；加之，羌活所含醌类、酚类物质较多，很易氧化变褐，因此对外植体材料的选择和消毒方法都非常关键。本专利技术首次采用组织培养方法，开展野生羌活种质离体繁殖工作，这为挽救濒危羌活材料，开展野生羌活遗传改良、促进羌活的工厂化育苗提供了一条新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过组织培养进行羌活种质保存和快速繁苗方法。本专利技术的技术方案是一种羌活组织培养繁殖方法，其特征在于以羌活萌发的根芽为外植体，经消毒处理、接种诱导形成愈伤组织后，再经愈伤组织增殖、诱芽培养和生根培养，长成完整的植株小苗，将完整小苗移栽到育苗基质中，长成正常羌活植株。所述的羌活组织培养繁殖方法，包括下列步骤A、外植体的选择和消毒处理以羌活萌发的根芽为外植体，以流水冲洗3～5分钟，再用浓度为75％的酒精浸泡灭菌45～60秒，以无菌去离子水冲洗2～3次，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1％～0.2％的升汞中，浸泡灭菌10～14分钟，无菌去离子水冲洗2～3次，备用；B、外植体接种将经过步骤A中备用的外植体切成0.1～0.3cm3的小块，接种在愈伤组织诱导培养基上，培养时间为30～35天，在根芽切口处膨大形成愈伤组织；C、愈伤组织增殖将步骤B中得到的愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上，愈伤组织增殖25～35天，长出黄色、致密的愈伤组织；D、愈伤组织的芽诱导将步骤C中得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上，培养35～45天，出现丛生羌活苗；E、生根培养将步骤D中得到的丛生羌活苗分株，转入生根培养基中，培养20～30天，小苗基部出现白色短根并长出完整根系；F、植株移栽移栽前，对含蛭石、泥炭的育苗基质消毒，将步骤E中得到的完整小苗直接移栽到育苗基质，无需炼苗可直接成活，长成正常羌活植株。所述的外植体消毒处理采用75％酒精浸泡灭菌45～60秒和0.1％～0.2％升汞浸泡灭菌10～14分钟的双重两次消毒方法。所述的致密的愈伤组织是指非颗粒状散在的愈伤组织。所述的羌活的基源植物为伞形科多年生草本植物羌活Notopterygiumincisum Ting ex H.T.Chang和宽叶羌活N.forbesii Boissieu。所述的愈伤组织诱导培养基为MS、KT 0.1～2.5mg/L、2，4-D 0.5～1.5mg/L、NAA 0.2～0.6mg/L，其中MS为常规基本培养基Murashige&Skoog1962，KT为6-糠基腺嘌呤(激动素)，2，4-D为2，4-二氯苯氧乙酸，NAA为萘乙酸。所述的愈伤组织增殖培养基为MS、KT 0.5～2.5mg/L、2，4-D 0.5～1.0mg/L，其中MS为常规基本培养基Murashige&Skoog 1962，KT为6-糠基腺嘌呤，2，4-D为2，4-二氯苯氧乙酸。所述的诱芽培养基为MS、6-BA 1.5～4.5mg/L、NAA 0.2～0.5mg/L，其中MS为常规基本培养基Murashige&Skoog 1962，6-BA为6-苄基腺嘌呤，NAA为萘乙酸。所述的生根培养基为1/2MS、NAA 0.01～0.05mg/L、2～3％的蔗糖、0.8％的琼脂，其中MS为常规基本培养基Murashige&Skoog 1962，将该常规基本培养基中的大量元素浓度减半得到1/2MS，NAA为萘乙酸。所述的愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基和诱芽培养基中均加入0.7～1.0％的琼脂、3％蔗糖和0.1～0.5％活性炭。所述的MS培养基的成分按常规为硝酸铵(NH4NO3)1650mg/L，硝酸钾(KNO3)900mg/L，硫酸镁(MgSO4·7H2O)370mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)170mg/L，氯化钙(CaCl2·2H2O)440mg/L，硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3mg/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6mg/L，硼酸(H3BO3)6.2mg/L，碘化钾(KI)0.83mg/L，钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25mg/L，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025mg/L，氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025mg/L，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8mg/L，Na2·EDTA·2H2O 37.3mg/L，甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L。所述的完整小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。所述的育苗基质的理化性质为总孔隙度为75％，有机质含量为20％。本专利技术的优点在于本专利技术利用组织培养进行离体快速繁殖在以下三方面有重要意义(1)繁殖速度快，不受气候因素影响，一年四季在室内均可繁殖，即启动快；(2)便于保持优良种性，即同步性好；(3)在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义，一株具有明显优势的羌活突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推广。本专利技术所用培养基诱发时间短、出苗快、增殖频率高，尤其出苗齐，无需炼苗可直接成活，易于操作，进行大规模生产。本专利技术首次采用组织培养方法，开展野生羌活种质离体繁殖工作，这为挽救濒危羌活种质资源，开展野生羌活遗传改良、促进羌活的工厂化育苗提供了一条新途径，提供了一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羌活组织培养繁殖方法，其特征在于：以羌活萌发的根芽为外植体，经消毒处理、接种诱导形成愈伤组织后，再经愈伤组织增殖、诱芽培养和生根培养，形成完整的植株小苗，将完整小苗移栽到育苗基质中，长成正常羌活植株。

【技术特征摘要】
1.一种羌活组织培养繁殖方法，其特征在于以羌活萌发的根芽为外植体，经消毒处理、接种诱导形成愈伤组织后，再经愈伤组织增殖、诱芽培养和生根培养，形成完整的植株小苗，将完整小苗移栽到育苗基质中，长成正常羌活植株。2.根据权利要求1所述的一种羌活组织培养繁殖方法，其特征在于所述的羌活组织培养繁殖方法，包括下列步骤A、外植体的选择和消毒处理以羌活萌发的根芽为外植体，以流水冲洗3～5分钟，再用浓度为75％的酒精浸泡灭菌45～60秒，以无菌去离子水冲洗2～3次，再将冲洗后的外植体置于浓度为0.1％～0.2％的升汞中，浸泡灭菌10～14分钟，无菌去离子水冲洗2～3次，备用；B、外植体接种将经过步骤A中备用的外植体切成0.1～0.3cm3的小块，接种在愈伤组织诱导培养基上，培养时间为30～35天，在根芽切口处膨大形成愈伤组织；C、愈伤组织增殖将步骤B中得到的愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上，愈伤组织增殖25～35天，长出黄色、致密的愈伤组织；D、愈伤组织的芽诱导将步骤C中得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上，培养35～45天，出现丛生羌活苗；E、生根培养将步骤D中得到的丛生羌活苗分株，转入生根培养基中，培养20～30天，小苗基部出现白色短根并长出完整根系；F、植株移栽移栽前，对含蛭石、泥炭的育苗基质消毒，将步骤E中得到的完整小苗直接移栽到育苗基质，无需炼苗可直接成活，长成正常羌活植株。3.根据权利要求1或2所述的一种羌活组织培养繁殖方法，其特征在于所述的羌活的基源植物为伞形科多年生草本植物羌活Notopterygiumincisum Ting ex H.T.Chang和宽叶羌活N.forbesii Boissieu。4.根据权利要求2所述的一种羌活组织培养繁殖方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋舜媛，陈学军，马小军，梁锦添，孙辉，
申请(专利权)人：蒋舜媛，四川诺托璞生态药材有限公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]