一种高效的脂肪酶基因定向进化方法技术

本发明专利技术提出了一种高效的脂肪酶基因定向进化方法，其步骤为１）酿酒酵母展示表达载体构建；２）脂肪酶酿酒酵母展示表达重组质粒构建；３）带载体同源序列的脂肪酶基因片段获得及表达突变文库的构建；４）展示表达突变文库及突变体分析。本发明专利技术将常规定向进化技术中突变文库的构建和突变体的表达实现同步，克服现有技术中脂肪酶分子定向进化操作步骤复杂、突变体筛选困难等缺点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术利用酿酒酵母同源重组结合微生物细胞表面展示技术，建立高效的 脂肪酶基因定向进化方法，涉及酶基因定向进化、分子改造的技术，属于生物

技术介绍
酶基因定向进化是改善酶的酶学性质最为有效的方法之一。90年代的DNA 改组技术开创了定向分子进化的新纪元。DNA改组是指DNA分子的体外重组， 是基因在分子水平上进行的有性重组。通过改变单个基因(或基因家族)原有的 核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。常规DNA改组技术及随后进过改进的技术虽然可以有效地提高目的基因的 突变频率，但其所有的腦A分子实验操作步骤均是在活体生物细胞外借助PCR 技术进行，而且所得到的突变体还必须要有效转化进入活体宿主细胞中才能实 现筛选，实验操作步骤繁琐，限制了突变体的高通量筛选。定向进化可以分为随机突变(突变体获得)和定向选择(突变体筛选)两 个阶段，定向进化技术发展到今天，突变体的获得不再是限制其发展的因素， 目前通过错误倾向PCR、 DNA shuffling等技术可以非常有效的获得突变体，然后一般利用大肠杆菌为宿主进行突变体文库构建。相关文献报道，很多酶在大 肠杆菌中往往以包涵体的形式表达，这样以大肠杆菌为宿主构建的突变文库就 难以实现高通量筛选。值得指出的是，无论是哪种DNA改组技术，其效果必须 由改组后基因表达产物的功能来进行验证。因此，灵敏可靠的选择或筛选方法 是DNA改组技术成功与否的关键。特别是针对脂肪酶基因的定向进化，获得突 变体文库后必须要使这些突变体能有效表达得到有活性的脂肪酶，才能实现突 变体的高通量筛选，因此高效的表达突变文库构建是脂肪酶分子定向进化的关 键所在。目前脂肪酶基因的定向进化主要分突变体获得和突变体表达两步进行。突 变体获得的方法有错误倾向PCR、 DNA shuffing等常规技术，所采用的方法均 无法回避细胞外的DNA操作，实验步骤复杂。突变体的表达方面，所采用的表 达系统主要是大肠杆菌表达系统，很多脂肪酶在此系统中均无法实现分泌表达， 或表达得到的是无生物学活性的包涵体。这样就不能进行直接有效的突变体筛 选，更不可能进行突变体的高通量筛选。需要进行细胞破碎、包涵体的变(复)4性分离得到脂肪酶，然后进行突变体筛选，所涉及的步骤复杂繁琐，难以实现 突变体的高通量筛选。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出一种利用酿酒酵母同源重组的特性结合微生物细胞表面展示技术，将不同来源的脂肪酶基因在细胞内实现活体DNA重组得到突变体， 并同时将各种突变体在微生物细胞表两展示表达得到有生物活性的脂肪酶。本 专利技术将常规定向进化技术中突变文库的构建和突变体的表达实现同步，克服现 有技术中脂肪酶分子定向进化操作步骤复杂、突变体筛选困难等缺点。本方法 亦可应用于其他酶分子的定向进化。以下是实现本专利技术目的的技术路线1. 酿酒酵母展示表达载体构建利用酵母细胞Flop膜蛋白或a-凝聚素、 a-凝聚素、等膜蛋白构建适合脂肪酶表达的展示表达载体。2. 脂肪酶酿酒酵母展示表达重组质粒构建利用酿酒酵母展示表达载体， 构建不同来源的脂肪酶基因(具有一定同源性)在酿酒酵母中展示表达 的重组载体。 '3. 带载体同源序列的脂肪酶基因片段获得及表达突变文库的构建根据展 示表达载体序列设计引物，PCR扩增带有酿酒酵母展示表达载体同源序 列的不同来源脂肪酶基因片段；将带有载体同源序列的脂肪酶基因片段 与线性化的展示表达载体混合，转化酿酒酵母，得到表达突变文库。4. 展示表达突变文库及突变体分析不同来源的脂肪酶基因在酿酒酵母中实现同源重组，得到展示表达突变文库，如图1示意。(具体操作详见实 施实例)本专利技术利用同源的核酸序列在酿酒酵母中可以发生同源重组的这一特性，将不同来源的脂肪酶基因(具有一定的序列同源性)利用酿酒酵母展示表达载体导入酿酒酵母细胞，使这些脂肪酶基因在酿酒酵母细胞内实现同源重组得到突变体，同时这些突变体可以有效地展示表达在酿酒酵母细胞表面，得到有活性的脂肪酶。这样即避免了常规基因定向进化中复杂的细胞外基因操作，同时又可以实现各种突变体基因在酿酒酵母细胞表面的展示表达，便于突变体的高通量筛选，从而实现脂肪酶基因在细胞内的活体定向进化。这种方法首次利用 酿酒酵母同源重组的性质结合微生物细胞表面展示技术构建表达突变文库，进行细胞内活体DNA改组(f/7-wVo DNA shuffling),省去了基因的核酸酶消化、 有性PCR产生突变体等DNA分子的体外操作，而且使突变体同步实现展示表达， 大大提高了脂肪酶分子定向进化的效率，为实现酶定向进化中突变体的高通量 筛选开辟新的技术路线。本专利技术获得杂合脂肪酶基因7//7必>7，其编码的脂肪酶突变体同时实现了在酿酒酵母细胞表面的展示表达，得到全细胞脂肪酶。脂 肪酶突变体酶学性质较其亲本有所改善，可以应用于脂肪酶催化的各种生物催 化反应。附图说明图l、不同的酶基因在酵母中同源重组示意，图2、酿酒酵母展示表达载体pLHJ042图谱，图3、重组质粒pLHJ044图谱，图4、重组质粒pLHJ042-B68图谱，图5、重组质粒pLHJ052图谱，图6、重组质粒pLHJ053图谱，图7、重组子橄榄油底物平板活性检测，图8、脂肪酶基因与7j'a/似的序列比较，图9、月旨肪酶基因hX&r7与7iA7^的序列比较，图10、脂肪酶基因7&必>7与7/p浙《的序列比较，图11、脂肪酶基因7&必>7与h》M 的序列比较，图12、脂肪酶基因h》H7序列来源，具体实施例方式下面结合具体实例对本专利技术作进一步阐述,但实施实例不限制本专利技术的保护范闺，具体实施实例如下 实施实例l: Fl叩膜蛋白介导的酿酒酵母展示载体的构建蛋白Flolp是在51 cereKJ'w'ae中由凡W基因编码一个类似凝聚素的细 胞壁蛋白，根据已报道的凡W基因(GenBank NO. NC—001133)全序列，设计Flolp 的凝絮功能区编码序列的引物F0Lf-Hind III和FOLr"Bgl II (F0Lf-Hind III: 5， 一acat朋gc"atgacaatgcctcatcgctatatgtttttg"3， FOLr—Bgl II: 5, -gata辟t"ggtgatttgtcctgaagatgatgatgacaaa-3，)， 以酿酒酵母 S ATCC 60715的总DM为模板PCR扩增得到Flolp的凝絮功能区编 码序列片断，将此片断经历Vxi III、 1I双酶切后与经历73d III、I双 酶切的酿酒酵母表达载体pYES2/NT在T4 DNA连接酶作用下连接(餘J II与M I互为同尾酶)，得到以Flolp凝絮功能区为介导锚合蛋白的酿酒酵母展示表达 载体pLHJ042，如图2。实施实例2:脂肪籌基因酿酒酵母展示表达重组质粒的构建 2. 1、荧光假单孢菌来源脂肪酶基因酿酒酵母展示表达载体构建 以脂肪酶基因"/7丑5^ (Genbank NO. AY623009)序列设计其全长基因引物 LipB52Pf (5， 一 aaa^朋"cccaacaLaaaagagaggcaacagcaatg—3， )、 LipB52Pr(5， -aaa^c叙ccgctccct本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效的脂肪酶基因定向进化方法，其特征在于步骤为：　１）酿酒酵母展示表达载体构建：　利用酵母细胞Ｆｌｏｐ膜蛋白或ａ－凝聚素、α－凝聚素、等膜蛋白构建适合脂肪酶表达的展示表达载体；　２）脂肪酶酿酒酵母展示表达重组质粒构建：　利用酿酒 酵母展示表达载体，构建不同来源、具有一定同源性的脂肪酶基因在酿酒酵母中展示表达的重组载体；　３）带载体同源序列的脂肪酶基因片段获得及表达突变文库的构建：　根据展示表达载体序列设计引物，ＰＣＲ扩增带有酿酒酵母展示表达载体同源序列的不同来源 脂肪酶基因片段；将带有载体同源序列的脂肪酶基因片段与线性化的展示表达载体混合，转化酿酒酵母，得到表达突变文库；　４）展示表达突变文库及突变体分析：不同来源的脂肪酶基因在酿酒酵母中实现同源重组，得到展示表达突变文库。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：江正兵，宋慧婷，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：83[]