一种Fe3O4@PMMA/PAMAM微球及其合成与固定化脂肪酶制造技术

本发明专利技术公开了一种Fe3O4@PMMA/PAMAM微球及其合成与应用，采用共沉淀法制备了油酸修饰的Fe3O4，再通过悬浮聚合法合成了聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球，使用发散合成法合成了Fe3O4@PMMA/PAMAM微球。然后使用戊二醛作为交联剂，将Fe3O4@PMMA/PAMAM微球应用于脂肪酶的固定化。与游离脂肪酶相比，Fe3O4@PMMA/PAMAM微球固定化脂肪酶能在更大的反应温度和反应pH值范围内保留较高的酶活且其具有优秀的热稳定性和pH稳定性，其对底物的亲和力也比游离脂肪酶更强。此外，Fe3O4@PMMA/PAMAM微球固定化脂肪酶还有着优秀的酶活和载酶量以及优异的重复使用性和储存稳定性。复使用性和储存稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种Fe3O4@PMMA/PAMAM微球及其合成与固定化脂肪酶


[0001]本专利技术属于酶的固定化与酶工程
，具体涉及一种聚酰胺
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胺树枝状大分子(PAMAM)接枝的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)磁性微球Fe3O4@PMMA/PAMAM的合成及其在固定化脂肪酶中的应用。

技术介绍

[0002]随着人类社会的发展，酶的重要性愈发凸显。因为与传统的化学催化剂相比，酶具有高效性、特异性、选择性以及反应条件温和等优势。最重要的是使用酶作为催化剂对环境友好，符合绿色可持续发展的理念。脂肪酶是一类功能多样，能催化酯分解、酯合成、酯交换等多种化学反应的酶，广泛应用于食品加工、药物合成、生物燃料生产、污染物去除等领域。但是由于游离酶的稳定性差，活性易受外界环境和反应条件影响而损失，难以分离回收再利用，通常不适合实际应用。酶固定化是提高游离酶的稳定性和重复使用性的一个简单且有效的方法。迄今为止，物理吸附、包埋和共价交联是将酶固定化到载体上的常用方法。由于酶和载体间通过弱相互作用相连，物理吸附和包埋两种方式可以使酶保持较高的酶活，但是容易使酶从载体上脱落。共价交联是一种有效的酶固定化方法，由于酶和载体间引入了化学键，使酶和载体间的连接很稳定。目前，戊二醛活化是共价连接酶和载体的最普遍的方法之一。
[0003]酶固定化中的载体自身的结构和特性对固定化酶的性能有很大影响，但是目前大部分普遍应用的酶固定化的载体都有着一些缺点。因此，开发一种性能优秀的酶固定化的载体是在酶的实际应用中亟待解决的重要问题。将几种载体结合起来应用，从而取得性能更好的酶固定化的载体是一种有效的解决办法。磁性材料除了具有粒径小、体积小、比表面积大、生物相容性好、低毒性等优点外，还拥有独特的超顺磁性且磁响应性强，这使其可以在外加磁场下实现快速分离回收。因此，磁性材料受到了大量的关注。Fe3O4纳米颗粒已经在酶的固定化中得到了广泛应用，但由于Fe3O4化学活性高，在空气中容易被氧化，而且由于缺乏有效的修饰方法，Fe3O4表面功能基团的数量受限，这直接影响了固定化酶的性能。聚酰胺
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胺树枝状大分子是一组具有规则且结构明确的有机聚合物，有着高度分支的分子结构和丰富且多功能的表面基团。聚酰胺
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胺树枝状大分子的理化性质可调，可以通过调整其结构来精确控制其性质，如形状、大小、极性和不同单元的官能团排列，从而获得优异的物理和化学特性。聚酰胺
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胺树枝状大分子的大小、外部功能基团的密度和刚性取决于它的接枝代数，树枝状大分子的接枝代数越高，灵活性越低，外部官能团的数量则呈指数增长，可以为附着酶提供更多的反应位点。聚酰胺
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胺树枝状大分子这类超支化聚合物还拥有优秀的生物相容性、稳定性和灵活性等优秀特性。在酶固定化领域中，聚酰胺
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胺树枝状大分子有着巨大的潜力，因为聚酰胺
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胺树枝状大分子可以促进酶与载体之间的多点相互作用，还可以保护酶的构象，其分支结构也可以为酶提供缓冲作用，以保护酶不直接附着在载体的表面。但与其他的大部分载体类似，难以分离回收是聚酰胺
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胺树枝状大分子在酶固定化中作为载体的主要缺点。本专利技术将聚酰胺
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胺树枝状大分子接枝到聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球
上，合成的材料兼具磁性材料以及聚酰胺
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胺树枝状大分子的优点且弥补了两者的缺陷。

技术实现思路

[0004]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种Fe3O4@PMMA/PAMAM微球的制备方法，并将其应用于固定化脂肪酶。采用共沉淀法制备了油酸修饰的Fe3O4，再通过悬浮聚合法合成了聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球，使用发散合成法合成了Fe3O4@PMMA/PAMAM微球。然后使用戊二醛作为交联剂，将Fe3O4@PMMA/PAMAM微球应用于脂肪酶的固定化。Fe3O4@PMMA/PAMAM微球兼具磁性材料以及聚酰胺
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胺树枝状大分子的优点且弥补了两者的缺陷。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案具体包括如下步骤：
[0005](1)将3.33g FeCl2·
4H2O和5.47g FeCl3加入500mL的三颈烧瓶中，再向其中加入200mL去离子水并在氮气保护下开始搅拌，排除体系内溶解的氧气后，开始加热至85℃，然后向反应体系中迅速倒入20mL NH3·
H2O，恒温反应5分钟后，向其中滴加7.5mL油酸，再恒温反应30分钟后，将产物冷却至室温，用磁铁磁分离固液产物并用去离子水洗涤产物，即可获得油酸修饰的Fe3O4。经真空干燥后，将产物在室温下保存。
[0006](2)将6.88g聚乙烯醇
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1788和250mL去离子水加入500mL的三颈烧瓶中，将混合物在磁力搅拌的条件下加热至90℃，然后加入6.25g NaCl，完全溶解后，水相即制备完成；将3g油酸修饰的Fe3O4、23.75mL甲基丙烯酸甲酯、2.5mL二乙烯苯和1g过氧化苯甲酰加入100mL烧杯中，将混合物在室温下搅拌，直至混合均匀后，油相即制备完成；将油相和水相在1000mL的三颈烧瓶中混合并在氮气保护下开始搅拌，排除体系内溶解的氧气后，开始加热至80℃，恒温反应10小时，反应完成后，将产物冷却至室温，用磁铁磁分离固液产物并用去离子水和乙醇依次洗涤产物，即可获得聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球。经真空冷冻干燥后，将产物在室温下保存。
[0007](3)将7.5g聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球、150mL N,N
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二甲基甲酰胺和75mL乙二胺加入500mL的三颈烧瓶中并在氮气保护下开始搅拌，排除体系内溶解的氧气后，开始加热至80℃，恒温反应8小时，然后将产物冷却至室温，用磁铁磁分离固液产物，再用去离子水和乙醇依次洗涤产物，将获得的氨化的磁性聚合物微球命名为G
‑
0。经真空冷冻干燥后，将产物在室温下保存；将7.5g经酰胺化反应后获得的磁性聚合物微球、150mL N,N
‑
二甲基甲酰胺和50mL丙烯酸甲酯加入500mL的三颈烧瓶中并在氮气保护下开始搅拌，排除体系内溶解的氧气后，开始加热至80℃，恒温反应8小时，反应完成后，将产物冷却至室温，用磁铁磁分离固液产物，再用去离子水和乙醇依次洗涤产物，经真空冷冻干燥后，将产物在室温下保存；然后再进行一次酰胺化反应，所得的材料为第一代Fe3O4@PMMA/PAMAM微球，称之为G
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1；重复上述反应即可制备第二代和第三代Fe3O4@PMMA/PAMAM微球，即G
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2和G
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3。
[0008]将20mg Fe3O4@PMMA/PAMAM微球、5mL pH为8.0的磷酸盐缓冲液和0.2mL戊二醛加入50mL的锥形瓶中。然后，将锥形瓶放入摇床中，在30℃，180rpm的条件下培养10小时，然后将活化的载体用磁铁磁分离并用去离子水洗涤；将20mg脂肪酶、5mL pH为8.0的磷酸盐缓冲液和活化后的载体加本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Fe3O4@PMMA/PAMAM微球的合成方法，其特征在于：首先采用共沉淀法制备了油酸修饰的Fe3O4，再以油酸修饰的Fe3O4为原料通过悬浮聚合法合成了聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球，再以聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球为原料使用发散合成法合成了Fe3O4@PMMA/PAMAM微球(聚酰胺
‑
胺树枝状大分子接枝的聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体过程包括以下步骤：(一)、油酸修饰的Fe3O4的制备：将2
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5g(优选3
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4g)FeCl2·
4H2O和4
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7g(优选5
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6g)FeCl3加入容器中，再向其中加入180
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220mL(优选190
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210mL)去离子水并在氮气保护下搅拌排除反应体系内溶解的氧气后，加热至80
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90℃(优选83
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87℃)，然后向反应体系中倒入18
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22mL(优选19
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21mL)氨的质量浓度23
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27％(优选24
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26％)NH3·
H2O，并恒温反应3
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7分钟(优选4
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6分钟)后，并向其中滴加6
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9mL(优选7
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8mL)油酸，再恒温反应25
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35分钟(优选28
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32分钟)后，将产物冷却至室温，固液分离收集固体产物，并用去离子水洗涤固体产物，干燥后即可获得油酸修饰的Fe3O4；(二)、聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球的合成：将5
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8g(优选6
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7g)聚乙烯醇1788和230
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270mL(优选240
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260mL)去离子水加入容器中，将混合物在磁力搅拌的条件下加热至85
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95℃(优选88
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92℃)，然后加入5
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8g(优选6
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7g)NaCl，完全溶解后，得水相；将1
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5g(优选2
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4g)油酸修饰的Fe3O4、22
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26mL(优选23
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25mL)甲基丙烯酸甲酯、1
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4mL(优选2
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3mL)二乙烯苯和0.5
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1.5g(优选0.8
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1.2g)过氧化苯甲酰加入容器中，将混合物在室温下搅拌混合均匀后，得油相；将油相和水相在容器中混合并在氮气保护下搅拌排除反应体系内溶解的氧气后，开始加热至75
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85℃(优选78
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82℃)，恒温反应8
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12小时(优选9
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11小时)，反应完成后，将产物冷却至室温，固液分离收集固体产物，并用去离子水和乙醇依次洗涤固体产物，干燥后即可获得聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球；(三)、Fe3O4@PMMA/PAMAM微球的合成：(1)酰胺化反应：将作为原料的6
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9g(优选7
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8g)聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球、130
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170mL(优选140
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160mL)N,N
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二甲基甲酰胺和60
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90mL(优选70
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80mL)乙二胺加入容器中并在氮气保护下搅拌排除反应体系内溶解的氧气后，开始加热至75
‑
85℃(优选78
‑
82℃)，恒温反应6
‑
10小时(优选7
‑
9小时)，然后将产物冷却至室温，固液分离收集固体产物，再用去离子水和乙醇依次洗涤固体产物，干燥后获得的氨化的磁性聚合物微球，命名为G
‑
0；(2)迈克尔加成...

【专利技术属性】
技术研发人员：李佥，郭俊宏，杨帆，李宪臻，李苗，黄帆，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：