玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的克隆及在盐胁迫中的应用制造技术

本发明专利技术专利属于玉米基因克隆领域，是对玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的克隆及在盐胁迫中的应用的研究。具体涉及玉米叶片总RNA提取、反转录成cDNA及实时荧光定量PCR(RT

【技术实现步骤摘要】
玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的克隆及在盐胁迫中的应用


[0001]本专利技术属于玉米基因克隆
，具体涉及一种玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的克隆在盐胁迫中的应用

技术介绍

[0002]作为人们主要的粮食作物及饲料来源之一的玉米，因其广泛的应用价值及低廉的成本，一直受到世界各国学者的重视和青睐。在我国，玉米已成为三大作物中总产量最高、种植面积最大、单产仅次于水稻的重要作物。然而，玉米对盐胁迫的耐受性是很弱的。当处于盐胁迫下，植株的生长会受到抑制，净光合速率、叶绿素含量和根系活力明显降低，且对地上部的影响大于对地下部的影响。过高的盐浓度可能导致玉米生长迟缓、作物减产甚至大面积枯萎。所以，玉米耐盐性的研究，对于提高玉米产量、培育优良耐性品种有重要意义。
[0003]膜脂的重要组成部分——鞘磷脂，其代谢产物鞘磷脂
‑1‑
磷酸(S1P)在动物细胞中是一种非常有效的脂质介导物，在动物系统的多个生物学过程中起到重要的作用。而鞘氨醇激酶(SphK)是S1P合成所需要的关键的酶，鞘氨醇在鞘氨醇激酶的催化下形成S1P。鞘氨醇激酶是一类新的脂类激酶，该酶具有高度的进化保守性,在人、小鼠、酵母和植物中有表达，在线虫和果蝇中有类似激酶存在。在哺乳动物中已经鉴定有SphK和SphK2这两种鞘氨醇激酶存在。根据近年研究发现，在植物体中也有S1P的存在，除了对植物的生长发育过程有作用以外，在逆境胁迫中也起到了必不可少的作用。最近已经被证明的是，合成S1P的酶——鞘氨醇激酶(SphK)，是由拟南芥(Arabidopsis thaliana)保护细胞中的植物激素脱落酸刺激产生的；S1P能有效地调控保护细胞的开闭。近年研究指出，S1P可能参与了植物体内的多种信号转导途径：
①
植物在对非生物胁迫时，其抗逆性与适应性主要取决于植物激素脱落酸(ABA)的控制，而S1P能参与ABA介导的干旱信号转导途径；
②
钙离子作为许多逆境胁迫的第二信使，对于植物体来说能产生提高抗逆性的非常好的作用。而S1P能参与调节植物体内钙离子浓度，并且可能在保卫细胞的信号转导过程中起作用，它可以通过引起钙离子浓度变化而影响气孔的开闭，S1P引起的气孔关闭程度与其在细胞体内的剂量呈现出特异性，高浓度引起的效应更快。然而,在植物抵抗盐胁迫时，S1P如何起作用，到目前为止仍然不清楚。研究植物抗逆系统中的各种酶，从而为植物抵抗逆境胁迫提供一个良好的育种策略，是目前研究的热点。为此，我们克隆鉴定了玉米中S1P合成和代谢有关的鞘氨醇激酶基因ZmSphK1。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因克隆、克隆方法，可以有效克隆和表达玉米ZmSphK1基因。
[0005]第一个目的是提供一种玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的克隆方法，具体步骤为：
[0006](1)材料的准备与处理：玉米自交系品种“1104”、品种“Mo17”由分子育种实验室提供。将营养土以及蛭石按照适量的比例混合后，挑选籽粒饱满的种子各10粒进行种植，将剪
取的叶片放在超低温冰箱中保存以供RNA提取使用；
[0007](2)玉米叶片的总RNA的提取：本实验采用Takara RNA提取试剂盒提取叶片的RNA，此外还需要DNaseⅠ反应去除所提RNA中的DNA污染。整个的提取过程都应该在冰上进行操作，并且佩戴口罩；
[0008](3)反转录成cDNA及实时荧光定量PCR(RT
‑
PCR)：本实验采用Takara的反转录试剂盒进行cDNA的合成，20μl的反应体系中加入4μl的RNA。按照设定的反应程序进行反转录，之后将反转录产物于
‑
20℃低温冰箱中保存备用；用荧光定量Real
‑
time RT
‑
PCR对ZmSphK1基因的表达进行分析，其方法如下：荧光定量PCR所用仪器为Qiagen公司的型号为Rotor
‑
gene Q荧光定量PCR仪器。所用的试剂盒TB Green
TM
Permix Ex taq
TMⅡ(Takara Cat#RR820A)。参照说明书配置25μl体系的PCR原液；PCR反应程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；4℃保存。反应结束后，数据分析应用2^ΔΔCT法
[12]，即：Fold Change＝2
‑
[(Ct处理
‑
Ct处理actin)
‑
(Ct对照
‑
Ct对照actin)]根据此表达式，可以初步判断ZmSphK1基因表达量的大致变化。
[0009](4)基因克隆：
[0010]合成引物：Zm
‑
ZmSphK1
‑
F：5
’‑
GATGCAAGAAACCAAGCATCGG
‑3’
；Zm
‑
ZmSphK1
‑
R：5
’‑
ATTCAAGGCGAGCACTTCCC
‑3’
[0011]使用步骤3反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系为：2
×
GC BufferⅡ25μl、dNTP 8μl、Zm
‑
ZmSphK1
‑
F1 1μl、Zm
‑
ZmSphK1
‑
R1 1μl、cDNA模板2μl、La Taq酶0.5μl、ddH2O 12.5μl；
[0012]PCR结束后琼脂糖凝胶电泳，回收约1100bp的条带，即获得玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因。
[0013]一种玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的在盐胁迫中的应用
[0014]本专利技术的第二个目的是为了提供一种所述的玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因的应用方法，具体为以下步骤：
[0015]S1,pMD19
‑
ZmZmSphK1重组质粒的构建：连接所述的玉米基因ZmZmSphK1的克隆与pMD19
‑
T载体，对纯化的基因ZmZmSphK1的克隆与pMD19
‑
T载体连接，得到重组质粒pMD19
‑
ZmZmSphK1；
[0016]S2,原核表达载体pET28a
‑
ZmSphK1的构建：以ZmZmSphK1
‑
Xba
Ⅰ‑
F和ZmZmSphK1
‑
BamHI
‑
R作为引物，以测序正确的PMD19
‑
T
‑
ZmZmSphK1质粒作为模板进行PCR扩增，切胶后纯化回收目的片段。把pET28a表达载体的质粒用限制性内切酶Xba I和BamHI进行双酶切。双酶切完成以后进行琼脂糖凝胶电泳，并将目的片段切胶回收，将PC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种玉米基因ZmSphK1的基因克隆方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)玉米叶片的总RNA的提取，反转录成cDNA：(2)以cDNA为模板，设计特异性引物，通过PCR扩增基因ZmSphK1的编码区序列，其中，PCR扩增所用的引物如下：Zm
‑
ZmSphK1
‑
F：5
’‑
CATTGAAGCTTCTGGCGTGC
‑3’
；Zm
‑
ZmSphK1
‑
R：5
’‑
GGGCTAACGAAGCAAAGTCC
‑3’
(3)使用步骤2反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系为：2
×
GC BufferⅡ25μl、dNTP 8μl、Zm
‑
ZmSphK1
‑
F1 1μl、Zm
‑
ZmSphK1
‑
R1 1μl、cDNA模板2μl、La Taq酶0.5μl、ddH2O 12.5μl；PCR结束后琼脂糖凝胶电泳，回收1100bp的条带，即获得玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1基因。2.根据权利要求1所述的玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1的克隆方法，其特征在于，将回收的1100bp的条带连接pMD19
‑
T中间载体转化入大肠杆菌感受态细胞中，保存备用。3.根据权利要求1所述的克隆方法经克隆得到玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1并使其在原核表达载体pET28a以及真核表达载体pCambia1300中表达。4.根据权利要求3所述的玉米鞘氨醇激酶ZmSphK1的原核表达载体pET28a
‑
ZmSphK1，其特征在于，包括以下操作步骤：(1)pET28a
‑
ZmSphK1重组载体的构建；(2)连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α；(3)提取质粒后转化...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵美爱，王可欣，宋希云，李军，刘新，郭新梅，裴玉贺，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：