一种检测BACE1的双模传感器及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物传感器领域，涉及一种检测BACE1的双模传感器，特别是指一种检测BACE1的双模传感器及其制备方法和应用。本发明专利技术首次采用鲁米诺和短肽共同修饰的银纳米颗粒作为电化学发光、电化学双模信号单元，利用CB[8]诱导鲁米诺和短肽P2共同修饰的银纳米颗粒聚集形成的三维聚集体为信号探针，进行信号标记和信号放大，从而提高了BACE1活性检测的灵敏度。值得注意的是，该双模传感器为BACE1活性的检测提供了多样化的分析数据，并显示出高选择性和可重复性。与单模传感器相比，这种双模传感器可以显著提高分析效率和精度，具有重要的科学意义和应用价值。意义和应用价值。意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种检测BACE1的双模传感器及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物传感器领域，涉及一种检测BACE1的双模传感器，特别是指一种检测BACE1的双模传感器及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]阿尔兹海默症是一种神经退行性疾病，其特点是大脑不同区域神经细胞功能的丧失。由β淀粉样肽组成的细胞外聚集体的逐步形成是阿尔兹海默症的病理特征。β
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分泌酶和γ
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分泌酶依次裂解淀粉样前体蛋白，生成β淀粉样肽。β位淀粉样前体蛋白裂解酶1作为淀粉样变途径的限速步骤，与认知正常的个体相比，阿尔兹海默症患者大脑中BACE1蛋白浓度和活性升高，因此BACE1被认为是阿尔兹海默症早期的治疗靶点，且已经研究了不同的BACE1抑制剂的抑制效果。
[0003]传统检测BACE1活性的方法包括高效液相色谱和质谱，这些方法尽管可靠，但较为耗时，仪器成本高。近年来，一些新的方法已经被报道用于检测BACE1的活性，如表面等离子体共振、比色、电化学和荧光。电化学发光是化学发光和电化学相结合的产物，具有背景信号低、动态范围宽、灵敏度高、控制简单、装置简单等优点，是免疫分析和临床诊断的有力工具。然而，传统的电化学发光检测只利用其光信号，而忽略了电流信号。电化学法具有成本低、设备小型化的优点，但存在重现性较差、抗干扰性较弱的缺点。公开号CN113820298A的专利公开了一种自组装超猝灭金纳米颗粒纳米传感器，该传感器包括：肽探针，为可被BACE
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1剪切的肽链，其上标记有荧光团；辅助DNA，其上标记有猝灭剂；以及，金纳米颗粒；其中，金纳米颗粒的表面组装至少一个肽探针和至少一个辅助DNA，辅助DNA与金纳米颗粒的连接端标记有荧光团，肽探针上的荧光团与辅助DNA上的淬灭剂相互接近。通过Cy5荧光信号的淬灭来计算BACE
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1的浓度，虽然在很大程度上提高了BACE
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1的灵敏度，但是并不能实现双模式互相矫正式检测。
[0004]与使用任何单一传感模式相比，电化学发光和电化学技术的结合可以提高分析的可靠性，同时可以提供更多样化的信息、更低的检测限和更高的精度，并纠正作为单一模式采用的任何一种技术的缺陷(检测条件、仪器偏差和信号容量限制)。与由两个不同的探针标记的双模传感器相比，单个探针所构建的传感器不仅简化了复杂的标记过程，还避免了两个探针之间的潜在干扰。但是现有的传感器的双模大多是指电化学与比色法结合或电化学发光与比色法进行结合，在检测BACE1蛋白时并未有将电化学和电化学发光相结合进行相互引证的双模传感器。为了进一步探索用于检测BACE
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1的双模传感器的可行性，本课题组进行了长期的探索。

技术实现思路

[0005]本专利技术提出一种检测BACE1的双模传感器及其制备方法和应用，本专利技术的电化学发光和电化学双模传感器特异性好、检测范围宽、灵敏度高并可用于他汀类抑制剂的筛选，电化学发光的检出限为33.11 pM，电化学的检出限为53.19 pM。
[0006]本专利技术的技术方案是这样实现的：一种检测BACE1的双模传感器，包括修饰有三维聚集体的玻碳电极，三维聚集体通过β
‑
环糊精修饰到玻碳电极上，其中三维聚集体指葫芦[8]脲、肽P1和信号单元的聚集体；信号单元为鲁米诺和短肽P2共修饰的银纳米粒子；肽P1的序列如SEQ ID No.1所示，其5
’
端修饰有金刚烷；短肽P2序列如SEQ ID No.2所示。
[0007]上述的检测BACE1的双模传感器的制备方法，金刚烷（ADA)功能化的肽P1(FEADLNVESIEETK
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ADA) 作为BACE1的底物，通过β
‑
环糊精与金刚烷之间的主
‑
客体相互作用连接在β
‑
环糊精修饰的玻碳电极上。然后该修饰电极在超分子葫芦[8]脲溶液里孵育，通过葫芦[8]脲与底物肽之间的主
‑
客体相互作用将葫芦[8]脲组装到底物肽的氮端。鲁米诺和短肽P2（FGDDPPPPC）共修饰的银纳米粒子同时具有电化学和电化学发光活性，被用作双模信号单元。该信号单元被超分子葫芦[8]脲诱导聚集形成三维聚集体，将三维聚集体作为信号探针进行信号放大，通过葫芦[8]脲与短肽P2（FGDDPPPPC）之间的主
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客体相互作用将信号探针标记到底物肽的氮端。在BACE1存在的情况下，底物肽被裂解，导致短肽（FEAD）脱离玻碳电极表面，标记到底物肽上的信号探针也随之减少，导致电化学发光和电化学信号的降低，利用信号的降低值与BACE1活性之间的关系来检测BACE1的活性。
[0008]具体的，上述的检测BACE1的双模传感器的制备方法，步骤如下：（1）葫芦[8]脲诱导的鲁米诺和短肽P2共修饰银纳米颗粒聚集体的合成首先，将3 mL 5 mM硝酸银加入含有5 mL超纯水和9 mL无水乙醇的溶液中，剧烈搅拌。然后，将0.5 mL 0.01M鲁米诺的氢氧化钠溶液(0.1M)加入上述溶液，得到黄色溶液。所有这些步骤都是在室温下进行的，连续搅拌2 h，颜色从浅黄色变为深黄色，表明成功地形成了鲁米诺修饰的银纳米颗粒。最后，在10000转/分的条件下离心10分钟，得到软质沉淀物。
[0009]用含有1% 三（二羧乙基）盐酸膦的0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH = 7.0）将一定体积的P2肽原液(1 μM)稀释到10 nM，并在室温下孵育1小时以激活肽中的巯基。随后，将制备好的鲁米诺修饰的银纳米颗粒与含有1 mg/mL 牛血清蛋白的P2（FGDDPPPPC）储备液在4℃下孵育过夜。牛血清蛋白被用来稳定鲁米诺修饰的银纳米颗粒并尽量减少非特异性吸附。然后在4℃下以12000 rpm离心20分钟，以去除多余的肽。最后，将沉淀物重新悬浮在200 μL的超纯水中，得到鲁米诺和短肽P2共修饰的银纳米颗粒的悬浮液。将10 μL 葫芦[8]脲溶液加入到该悬浮液中1.5小时(最终浓度为47.62 μM)后就得到了鲁米诺和短肽P2共修饰银纳米颗粒的三维聚集体，离心后重新分散至100 μL的超纯水中，得三维聚集体悬浮液。
[0010]（2）检测BACE1的双模传感器的组装
①ꢀ
将直径为2.5
‑
3.5 mm的玻碳电极依次用1.0、0.3、0.05 μm的三氧化二铝抛光粉处理，将电极表面打磨成镜面，在乙醇和纯水中依次清洗并在红外灯下烤干；
②ꢀ
将经步骤
①
处理的玻碳电极浸入含6 mM β
‑
环糊精的0.05 M PBS溶液 (pH = 5.0) 为电解液中，通过循环伏安扫描将β
‑
环糊精电聚合到玻碳电极表面。电聚合后，用去离子水仔细清洗电极表面的吸附物质；
③ꢀ
将经步骤
②
处理的玻碳电极浸泡到5 μM的底物肽P1溶液中，于4℃条件下过夜孵育；
④ꢀ
取出经步骤
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种检测BACE1的双模传感器，其特征在于：包括修饰有金刚烷功能化的肽P1的玻碳电极、葫芦[8]脲溶液和信号探针溶液，其中金刚烷功能化的肽P1通过β
‑
环糊精修饰在玻碳电极上；信号探针为经葫芦[8]脲诱导鲁米诺和短肽P2共修饰的银纳米颗粒子聚集形成的三维聚集物；肽P1的序列如SEQ ID No.1所示，其5
’
端修饰有金刚烷；短肽P2序列如SEQ ID No.2所示。2.权利要求1所述的检测BACE1的双模传感器的制备方法，其特征在于：以金刚烷功能化的肽P1为检测底物，通过β
‑
环糊精与金刚烷之间的主
‑
客体相互作用连接在β
‑
环糊精修饰的玻碳电极上，然后将经过修饰的玻碳电极在超分子葫芦[8]脲溶液中孵育，通过葫芦[8]脲与肽P1之间的主
‑
客体相互作用将葫芦[8]脲组装到肽P1的氮端；以鲁米诺和短肽P2共修饰的银纳米粒子为信号单元，该信号单元经葫芦[8]脲诱导聚集得三维聚集体，以三维聚集体作为信号探针，通过葫芦[8]脲与短肽P2之间的主
‑
客体相互作用将信号探针标记到肽P1的氮端，即得检测BACE1的双模传感器。3.根据权利要求2所述的检测BACE1的双模传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将硝酸银加入醇水溶液中剧烈搅拌，然后再加入含有鲁米诺的氢氧化钠溶液，继续搅拌，使颜色由浅黄变成深黄，最后离心分离沉淀，所得软质沉淀物即为鲁米诺修饰的银纳米颗粒；（2）配制短肽P2储备液，室温孵育后，将步骤（1）制备的鲁米诺修饰的银纳米颗粒与含有牛血清蛋白的短肽P2储备液在4℃下孵育过夜，然后离心去除多余的肽，所得沉淀物重悬于超纯水中，即得鲁米诺和短肽P2共修饰的银纳米颗粒的悬浮液；（3）将葫芦[8]脲溶液加入步骤（2）的悬浮液中，反应完全后，离心重新分散到超纯水中，得三维聚集体悬浮液；（4）将经抛光、清洗后的玻碳电极浸入含有β
‑
环糊精的PBS溶液中，经电聚合后用去离子水清洗玻碳电极，然后浸泡至肽P1溶液中，4℃孵育过夜，所得玻碳电极经PBS溶液清洗后再浸泡至牛血清白蛋白溶液中，孵育后再用PBS溶液清洗，得修饰过的玻碳电极；（5）修饰过的玻碳电极、三维聚集体悬浮液和葫芦[8]脲溶液组成双模传感器体系。4. 根据权利要求3所述的检测BACE1的双模传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中硝酸银和鲁米诺的物质的量比为3: 1。5. 根据权利要求4所述的检测BACE1的双模传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦秀华，范界，周艳丽，董辉，张银堂，徐茂田，
申请(专利权)人：商丘师范学院，
类型：发明
国别省市：