聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开的聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白，是一种免疫原性低、具有 抗肿瘤和抗病毒活性的聚乙二醇和蛋白质的结合物，其特征在于在α-苦瓜素分子表面 的氨基上连接有至少一分子聚乙二醇。本发明专利技术还公开了聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体 失活蛋白的制备方法。本发明专利技术提供的聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白不仅保持 了未修饰前苦瓜籽核糖体失活蛋白的60～80％抗肿瘤生物活性，且与未修饰的苦瓜籽 核糖体失活蛋白相比其免疫原性和毒副作用已显著降低。本发明专利技术提供的制备聚乙二醇 修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法也简单方便，易于控制和规模生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药用蛋白质化学修饰
，具体涉及一种用聚乙二醇化学修饰的 抗肿瘤和抗病毒苦瓜籽核糖体失活蛋白及其制备方法。
技术介绍
病毒性感染、恶性肿瘤以及由病毒感染所引发的肿瘤是严重危害人类健康的疾病。 传统的抗病毒类药物主要以病毒逆转录酶或蛋白酶为靶标，开发的相关抑制剂。但该 类药物存在不能完全清除病毒、易产生耐药性、毒副作用大及药价昂贵等一系列问题。 因此，开发新型特效抗肿瘤、抗病毒药物一直是科学家们面临的重大课题。近十多年 来，在丰富的植物资源中挖掘抗病毒药物已成为人们关注的重点，，苦瓜籽核糖体失活蛋白(RIP)就是有待开发的特效药物成分之一。目前，从苦瓜中分离得到的多种核糖体失活蛋白，包括a-苦瓜素(a-Momorcharin)、 p-苦瓜素(卩-Momorcharin) 、 y-苦瓜素(y-Momorcharin) 、 S-苦瓜素(5-Momorcharin)和 MAP30(Momordicaanti-HIV protein of 30 kD)等。它们为分子量28 30kD，等电点8.8 9.2之间的碱性糖蛋白，都属于I型核糖体失活蛋白。a-苦瓜素、P-苦瓜素和MAP30等 都具有抗肿瘤抗肿瘤等生物学功能(Zheng YT, Ben KL, Jin SW et al..a-Momorcharin inhibits HP/-1 replication in acutely but not chronically infected T-lymphocytes.Acta Pharma-cologicaSinica.1999 20:239—243; Lee Huang S,Huang P L,Chen H C,et al，Anti-HIV and anti tumor activities of recombinant MAP30 from bitter melon,Gene，1995，161(2)151-156; Sun Y,Huang P L,Li J J,et al,Anti-HIV agent MAP30 modulates the expression profile of viral and cellular genes for proliferation and apoptosis in AIDS-related lymphoma cells infected with Kaposi'ssarcoma-associated virus，Biochem Biophys Res Commun，2001,287:983-994; Stirpe F,Ribosome-inactivating proteins,Toxicon，2004,44:371-383)。本专利专利技术人经研究 也发现苦瓜籽核糖体失活蛋白对人肝癌细胞、Vero、 SP2/0、 3T3、 Kb、 Navana等肿瘤 细胞株均表现有不同程度的抑制作用，而对完整细胞人胚肺二倍体细胞却毒性极小； 同时也发现苦瓜籽核糖体失活蛋白对疱疹病毒、麻疹病毒、乙肝病毒、乙脑病毒及腺 病毒等均有明显的抑制作用(孟延发，杜毅峰，张雪梅,苦瓜籽核糖体失活蛋白的理化性质及生物活性，中国生物化学与分子生物学，1999，15(6):920-923)。上述这些研究结果充分 显示了苦瓜籽核糖体失活蛋白具有潜在的临床药用价值。虽然依据科技人员的研究显示了苦瓜籽核糖体失活蛋白具有潜在的抗病毒或抗肿 瘤的临床药用价值，但由于苦瓜籽核糖体失活蛋白属于异源蛋白，因而它与其它的异 源蛋白一样，不可避免都会在人体体内多次使用后产生免疫原性、毒副作用、半衰期 短、稳定性差等问题，这无疑将严重影响其在临床上的推广应用。
技术实现思路
本专利技术目的是针对苦瓜籽核糖体失活蛋白作为异源蛋白存在的上述问题，提供一 种用聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白。经聚乙二醇修饰后的该蛋白的免疫原性 和毒副作用可显著降低，且生物活性可保持60 80%，以为促进临床上的推广应用奠 定基础。本专利技术的另一目的是提供一种制备聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法。本专利技术涉及的苦瓜籽核糖体失活蛋白(a-MC)的基本性质和结构特点是分子量约 为30KD、由263个氨基酸组成的单链多肽、属于I型核糖体失活蛋白、等电点为8.9-9.0 的碱性糖蛋白、其N-末端氨基酸的特征序列为NH2-Asp-Val-Ser-Phe-Arg-Leu-Ser-Gly-AIa-Asp-。本专利技术提供的聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白，其特征在于在苦瓜籽 核糖体失活蛋白的氨基上连接有至少一条聚乙二醇分子链。且连接其上的每条聚乙二 醇分子链的重均分子量为2,000 100,000。由于未经修饰的a-MC有多个抗原决定位点，当其作为药物用于人体时易发生免 疫反应和毒副作用等，用非免疫原性的PEG对a-MC进行修饰，PEG上的活性基团就 可与a-MC特异性位点结合，遮盖a-MC的部分抗原决定簇，从而降低其免疫原性和 抗原性，并可延长在体内的半衰期，提高a-MC的作用效果。本专利技术提供的制备聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白的方法，其特征在于该 方法是先在质量份为1~4份苦瓜籽核糖体失活蛋白中加入缓冲液调节pH至7.0 9.0， 然后加入质量份为5~50份的聚乙二醇或其衍生物，在温度0 25'C下振摇反应3~30 分钟，将反应混合液进行分离，即得聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白 (a-MC-PEG)。其中该方法所用的a-MC可以是从苦瓜籽中提取获得的，也可以是通过基因重组 方法或其它方法获得的与其结构相似的多肽。该方法所用的聚乙二醇或其衍生物的重均分子量为2，000 100，000。其中聚乙二醇 衍生物为琥珀酸亚胺类聚乙二醇((mPEG)2-Lys-NHS)、醛类聚乙二醇(PEG-ALD)、 氟磺酸类聚乙二醇(PEG-TRES)、环氧类聚乙二醇(PEG-EPOX)中的任一种。该方法所用的缓冲液为硼砂缓冲液或磷酸缓冲液或其他适宜的缓冲液。制备a-MC-PEG结合物的代表性反应按下式进行0CH3,CH2CH2—0—C—NHn 〖 H2]3CH2 0 I z II ^ CH—C—0—N'CH3+OCH2CHtO—C-NH0+ 頭-s如-a-MC(mPEG)2-Lys-NHS丄pH7 9 (mPEG)2-Lys誦a-MC式中n-44 2200。 (mPEG)2-Lys-NHS中m代表单甲氧基(monomethoxy)的缩写， NHS酯(琥珀酸亚胺酯)代表PEG分子上的活泼基团，它与a-MC分子表明的Lys (赖 氨酸)侧链的氨基发生共价反应。除了NHS酯外，PEG分子上的活泼基团也可以是醛 (Aldehyde)、甘氨酰酯(Glycidyl ester)等。采用将反应混合液进行分离的方法既可以为色谱法，也可以为其他分离方法，如 离子交换法、高压液相色谱法等。采用色谱法时所用的层析介质为Sephacryl S-200、 Superdex 200、 Sephadex G-200、以Q为介质的RP-HPLC或以Cg为介质的RP-HPLC 中的任一种，流动相为含氯化钠的缓冲液或其他适宜的洗脱剂。层析介质和流动相不 限于这些品种，也可采用其他本文档来自技高网...

【技术保护点】
聚乙二醇修饰的苦瓜籽核糖体失活蛋白，其特征在于在苦瓜籽核糖体失活蛋白的氨基上连接有至少一条聚乙二醇分子链。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孟延发，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90