ZmCCS基因对玉米耐热性改良的应用及提高玉米耐热性的方法技术

本发明专利技术实施例公开了ZmCCS基因对玉米耐热性改良的应用及提高玉米耐热性的方法，通过降低玉米植株中ZmCCS的表达来增强玉米的耐热性。其中，提高玉米耐热性的方法，包括：以pCMV201

【技术实现步骤摘要】
ZmCCS基因对玉米耐热性改良的应用及提高玉米耐热性的方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种ZmCCS基因对玉米耐热性改良的应用及提高玉米耐热性的方法。

技术介绍

[0002]全球变暖的加剧严重制约了农作物的产量，短期内的升温会使作物处于高温胁迫的状态，影响开花、授粉、结实等生长发育的过程。玉米作为世界主要的粮食和经济作物，其产量会直接影响农、工业的各个环节，玉米的生长发育受到高温胁迫的影响，极端高温气候严重抑制玉米的产量，因此选育玉米耐高温胁迫的优良品种是玉米生产的关键之一。
[0003]传统的育种主要是通过自交、杂交不断进行传代培育以获得优良的性状，这种方法有育种周期较长、性状检测容易受到环境影响、传代规模大、操作复杂等缺点。

技术实现思路

[0004]本专利技术实施例提供一种ZmCCS基因的应用，通过降低玉米植株中ZmCCS的表达来增强玉米的耐热性。
[0005]本专利技术实施例提供一种提高玉米耐热性的方法，包括：
[0006]以pCMV201
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2bN81载体为骨架，构建基于黄瓜花叶病毒CMV的VIGS载体；
[0007]通过农杆菌将VIGS载体转入至烟草中培养扩繁病毒；
[0008]利用针刺法将病毒的提取物转入玉米种子以获得ZmCCS沉默表达的转基因玉米株系。
[0009]本专利技术公开的Copper Chaperone For Superoxide Dismutase(CCS)基因在调控玉米高温胁迫耐受性中的应用，通过构建miR398不敏感形式的ZmrCCS转基因株系以及CMV
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ZmCCS沉默转基因株系并进行高温胁迫实验。其中ZmrCCS转基因株系的构建利用了氨基酸密码子的同义突变，使ZmrCCS不能被miR398识别从而表达量升高，但氨基酸序列不发生改变，即不影响ZmCCS蛋白正常行使功能。试验证明ZmCCS的高表达使得玉米对高温胁迫更加敏感，而降低ZmCCS基因表达可以提高玉米的耐热性。
[0010]本专利技术通过病毒诱导的基因沉默(virus
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induced gene silencing，VIGS)技术，构建了基于黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus，CMV)的VIGS载体，通过针刺接种玉米种子的方法获得CMV
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ZmCCS沉默转基因株系。结果表明，ZmCCS的低表达有利于提高玉米的耐热性，通过培育CMV
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ZmCCS转基因玉米株系可以得到耐热性增强的植株。本专利技术为玉米耐热性品种的培育和改良提供了理论基础，在农业生产上具有重要的应用前景。
附图说明
[0011]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于
本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0012]图1为本专利技术提供的ZmrCCS转基因株系的构建和鉴定图；
[0013]图2为本专利技术提供的CMV
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ZmCCS沉默转基因株系的构建和鉴定图；
[0014]图3为本专利技术提供的ZmrCCS转基因株系与C01野生型高温胁迫前后的差异分析图；
[0015]图4为本专利技术提供的CMV
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ZmCCS转基因株系与C01野生型高温胁迫前后的差异分析图。
具体实施方式
[0016]为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
[0017]Copper Chaperone For Superoxide Dismutase(CCS)蛋白在拟南芥中被报道是一种分子伴侣蛋白，主要功能是负责将铜离子转运到Superoxide Dismutase(SOD)蛋白中，以激活其超氧化物歧化酶的酶活，参与植物活性氧的清除途径，在多种生物和非生物胁迫调控通路中发挥作用。
[0018]MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于动植物体内的内源性非编码RNA，长度约为21nt～24nt，主要功能是在转录后水平调控靶基因的表达，包括与靶mRNA配对引起其降解和通过翻译抑制调控靶基因的表达，从而参与调节植物的生长发育和逆境胁迫适应性。
[0019]在本专利技术中，利用miR398特异性靶向ZmCCS mRNA的特点，通过氨基酸密码子的同义突变设计了能够抵抗miR398切割作用的片段并构建载体转化玉米，得到了ZmrCCS转基因株系；此外，通过扩增ZmCCS的cDNA片段并克隆到黄瓜花叶病毒VIGS载体中，转染玉米得到CMV
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ZmCCS沉默转基因株系。进行高温胁迫发现，ZmrCCS转基因株系表现出对高温胁迫更加敏感，而CMV
‑
ZmCCS沉默转基因株系表现出更强的耐热性。
[0020]VIGS利用了植物抵抗病毒胁迫的反应机制，病毒在入侵植物的过程中会产生双链RNA，它们会被植物的Dicer
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like protein 4(DCL4)识别并被切割形成21
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24nt的Small interfering RNA(siRNA)，并与Argonaute1(AGO1)等蛋白形成RNA诱导沉默复合体，并特异性地靶向同源的RNA序列引起转录后基因沉默。当将植物基因的cDNA片段克隆到入侵病毒的VIGS载体中并成功转染植株，这种RNA沉默机制在沉默病毒RNA的同时也会沉默植物中内源的相关基因。
[0021]方法：
[0022](1)ZmrCCS转基因株系的构建：本专利技术通过对ZmCCS基因进行同义突变，在不改变ZmCCS蛋白质序列的前提下，突变miR398的靶向位点，使得ZmCCS脱离miR398的抑制从而过量表达，并创制ZmrCCS转基因材料进行高温胁迫实验。
[0023]请参阅图1，图1为ZmrCCS转基因株系的构建和鉴定图(图A：rCCS片段设计，红色字体代表氨基酸单碱基同义突变，突变后能有效抵抗miR398的切割作用；图B：rCCS表达载体构建示意图；图C：ZmrCCS
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11
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2转基因植株ZmCCS基因的RT
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qPCR定量结果，11
‑2‑
1至11
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5为鉴定为纯合株系的材料，C01为野生型玉米的材料；图D：ZmrCCS
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16
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1转基因植株ZmCCS基因的RT
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qPCR定量结果，16
‑1‑
1至16
‑1‑
5为鉴定为纯合株系的材料)。利用定点突变技术设计突变引物(如图1A)，通过PCR扩增获得ZmrCCS片段，ZmrCCS片段长度为924bp，以
pCAMBIA3301载体为骨架，启动子为ZmCCS基因内本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ZmCCS基因的应用，其特征在于，通过降低玉米植株中ZmCCS的表达来增强玉米的耐热性。2.一种提高玉米耐热性的方法，其特征在于，包括：以pCMV201
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2bN8...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘琳，何文博，左志芳，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：