本发明专利技术公开了测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法（ＥＬＩＳＡ），其特点是合成氨基无色孔雀石绿的修饰物并将其与蛋白联接，制得免疫原及包被抗原，通过免疫动物获得兔抗无色孔雀石绿的多克隆抗体，ＥＬＩＳＡ标准曲线的浓度范围为０．１～１００ｎｇ／ｍＬ，ＩＣ↓［５０］为０．９－２．６ｎｇ／ｍＬ，加标回收率为７６．２－９５．０％，ＥＬＩＳＡ与ＨＰＬＣ的相关系数为０．９７５，ｎ＝７；由于所制抗体与孔雀石绿的交叉反应率分别为９５．２５％，故ＥＬＩＳＡ可以用于测定孔雀石绿和无色孔雀石绿的总量，而无需将任何氧化步骤。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸 附分析方法(ELISA)，属于食品安全监督或食品分析的研究领域。二.
技术介绍
孔雀石绿(Malachite Green, MG)又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿和中国绿，为带 有金属光泽的绿色结晶体，化学名称四甲基代二氨基三苯甲烷，分子式为C23H25N2CI， 分子量为364.92，易溶于水、甲醇和乙醇，溶液呈蓝绿色。孔雀石绿是一种人工合成的 三苯基甲垸类工业染料，主要用于制陶、纺织、皮革和食品等产业上的颜色剂和细胞化 学上的染色剂等。孔雀右绿具有抗菌、杀虫等功效，是药用染料中抗菌效力较强的一类, 被广泛用作驱虫剂和杀菌剂，以杀灭水产动物体外的寄生虫，原生动物和鱼卵中的霉菌 等。孔雀石绿对防治水霉病等有特效，在水产养殖中曾大量使用。孔雀石绿在生物体内 会很快转化为无色孔雀石绿(LeucomalachiteGreen， LMG)。无色孔雀石绿是孔雀石绿在 生物体内的主要代谢物和主要存在形式。孔雀石绿及无色孔雀石绿在环境水体和水生物 体内均可存留较长时间。近年来国内外研究表明孔雀石绿为潜在的致癌、致畸、致突变物质，而其代谢物无 色孔雀石绿被确证具有高毒、高残留和三致作用，因此，孔雀石绿的使用污染水环境， 其代谢物无色孔雀石绿对水生物及人体健康造成极大危害。美国、加拿大、日本、欧盟 等许多国家都将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。欧盟规定水产品中孔雀石绿和无色孔 雀石绿总量不得超过2pg/kg。我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的 兽药及其化合物清单》中。测定孔雀石绿和无色孔雀石绿的主要方法是色谱分析方法，包括气相色谱(GC)、高 效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等。HPLC-紫外可见检测器(UV) 为最常用的检测方法。孔雀石绿的最大吸收波长为618nm，利用HPLC-UV检测，背景 干扰小，测量结果准确。无色孔雀石绿在可见区无吸收，利用HPLC-UV检测，背景干 扰严重，难以获取精确的结果，故常利用氧化剂如二氧化铅或2,3-二氯-5，6-氰基-1,44-苯醌将无色孔雀石绿氧化为孔雀石绿后进行检测。无色孔雀石绿也可利用高效液相色 谱-荧光检测法检测。色谱分析方法虽然灵敏度较高、准确性较好，但是色谱法仪器昂 贵、样品预处理复杂、费时、检测成本高，不适用于大量样品的筛选。酶联免疫吸附分析法(ELISA)具有灵敏度高、特异性强、分析快速的优点，己广 泛用于临床、药物、食品和环境等分析领域。到目前为止，仅有一篇用ELISA测定孔雀 石绿和无色孔雀石绿的文献报道(Yang, et al. / /I^r/c. /^odC力棚.2007. 55, 8851-8856)， 但抗体的交叉反应小，孔雀石绿或无色孔雀石绿只能由相应的抗体所建立的ELISA测定。 最近，测定孔雀石绿或无色孔雀石绿总量的ELISA试剂盒也已上市(Bioscientific Com),但此试剂盒价格昂贵，且需要一个额外的样品处理步骤，即在测定前须将无色孔 雀石绿氧化成孔雀石绿。 三.
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足而提供一种测定水样及水产品中孔雀石绿和 无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，其特点是利用抗无色孔雀石绿 抗体与孔雀石绿的髙交叉反应率，同时测定孔雀石绿和无色孔雀石绿残留总量，而无需 氧化步骤。本专利技术的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为重量份数。测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析法(1) 无色孔雀石绿衍生物的制备取5.5 7.5g对硝基苯甲醛溶于14 18gN，N-二甲基苯胺中，加入4.8 6.8g ZnCl2，于 温度80~100°(:搅拌反应直至绿色溶液形成固体，冷却至室温，固体溶于丙酮，同时过滤 除去ZnCl2颗粒，粗产品过柱纯化、干燥，得硝基无色孔雀石绿黄色粉末，取0.17 (U7g 硝基无色孔雀石绿溶于6 10mL甲醇中，以5%钯碳为催化剂，加入反应釜中，通入氢气， 于温度100 120'C反应1 5小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干溶液，粗 产品用体积比为95:5的甲醇:苯混合液重结晶，得到氨基无色孔雀石绿白色粉末；(2) 免疫原及包被抗原的制备取30~40mg纯化的氨基无色孔雀石绿溶于0.6mL水中，缓慢滴加浓度为15mg/mL 的NaN02溶液0.33mL，用盐酸调节混合液的pH值至1.5,在暗处、温度4"C反应过夜， 取少量上述溶液，滴加到N， N-二甲基苯胺中，溶液颜色由无色变为淡黄色，表明重氮 化反应完成；将10.5 mg氨基磺酸胺溶于0.21 mL纯水中，缓慢滴加到重氮盐溶液中，终止反应；称取牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)各100 mg，分别溶于1.5mL浓度为 0.01mol/L pH 7.5的磷酸盐缓冲溶液中;将重氮化溶液缓慢滴加至上述蛋白质溶液中， 用NaOH溶液调节pH值为7.5，搅拌下于温度4'C反应过夜；将混合物离心，取上清， 装入透析袋中，透析数天，获得两种无色孔雀石绿-蛋白质溶液，冷冻干燥，在温度-20'C 保存待用；无色孔雀石绿-牛血清白蛋白(LMG-BSA)和无色孔雀石绿-卵清蛋白 (LMG-OVA)分别用作免疫原及包被抗原；(3) 无色孔雀石绿多克隆抗体的制备用免疫原免疫两只新西兰大白兔，将l~4mg免疫原溶于0.5~4mL的生理盐水中， 加入0.5~3mL完全福氏佐剂，混合成油包水的乳浊液，每只兔子每次吸取0.5~2.0mL 乳浊液，多点皮下注射入兔子背部，1~5周后，对兔进行第二次免疫，使用不完全福氏 佐剂，其余与第一次免疫相同，第二次免疫后，2 5周进行下一次免疫，并且第三次、 第四次免疫后，5 7天抽取0.1 0.5mL耳血，检测抗体产生的情况，第五次免疫后，5~15 天处死兔子，取全血，将血液在冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于低温冰箱中 储存，即得兔抗无色孔雀石绿多克隆抗体；(4) 建立测定无色孔雀石绿含量的酶联免疫吸附分析方法对所得抗体性能进行表征，在最优试验条件下，建立测定无色孔雀石绿的ELISA; 本专利技术的优点1. 制备出抗无色孔雀石绿多克隆抗体，且所制备出的抗体与孔雀石绿的交叉反应率 为95.25%，以此抗体为基础建立了测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石 绿总量的酶联免疫吸附分析方法。2. 灵敏度高，与已报道的最灵敏的ELISA结果相近。3. 样品处理简单、测试量大、测试费用低。4. 对样品的测定，ELISA与HPLC有很好的相关性。 四附图说明图1.无色孔雀石绿(LMG)、牛血清白蛋白(BSA)和无色孔雀石绿-牛血清白蛋白 (LMG-BSA)交联物的紫外-可见光谱图 LMG和BSA分别在260 nm和280 nm处有特征吸收峰，LMG-BSA在367nm出 现一峰，为LMG与BSA交联所形成的更大的共轭体系的特征峰，表明无色孔雀石绿 已成功与蛋白交联。6无色孔雀石绿(LMG)、卵清蛋白(OVA)和无色孔雀石绿-卵清蛋白(LMG-OVA) 交联物的紫外-可见光谱图与图1相似 图2. ELISA测定无色孔雀石绿的平均标准曲线(『9)。无色孔雀石本文档来自技高网...
【技术保护点】
测定水样及水产品中孔雀石绿和无色孔雀石绿总量的酶联免疫吸附分析方法，其特征在于该方法包括以下步骤： （１）无色孔雀石绿衍生物的制备 取５．５～７．５ｇ对硝基苯甲醛溶于１４～１８ｇ Ｎ，Ｎ－二甲基苯胺中，加入４．８～６．８ｇ ＺｎＣｌ↓［２］，于温度８０～１００℃搅拌反应直至绿色溶液形成固体，冷却至室温，固体溶于丙酮，同时过滤除去ＺｎＣｌ↓［２］颗粒，粗产品过柱纯化、干燥，得硝基无色孔雀石绿黄色粉末，取０．１７～０．２７ｇ硝基无色孔雀石绿溶于６～１０ｍＬ甲醇中，以５％钯碳为催化剂，加入反应釜中，通入氢气，于温度１００～１２０℃反应１～５小时，过滤反应物，收集滤液，用旋转蒸发仪旋干溶液，粗产品用体积比为９５∶５的甲醇∶苯混合液重结晶，得到氨基无色孔雀石绿白色粉末； （２）免疫原及包被抗原的制备 取３０～４０ｍｇ纯化的氨基无色孔雀石绿溶于０．６ｍＬ水中，缓慢滴加浓度为１５ｍｇ／ｍＬ的ＮａＮＯ↓［２］溶液０．３３ｍＬ，用盐酸调节混合液的ｐＨ值至１．５，在暗处、温度４℃反应过夜，取少量上述溶液，滴加到Ｎ，Ｎ－二甲基苯胺中，溶液颜 色由无色变为淡黄色，表明重氮化反应完成；将１０．５ｍｇ氨基磺酸胺溶于０．２１ｍＬ纯水中，缓慢滴加到重氮盐溶液中，终止反应； 称取牛血清白蛋白和卵清蛋白各１００ｍｇ，分别溶于１．５ｍＬ浓度为０．０１ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．５的磷酸盐缓 冲溶液中；将重氮化溶液缓慢滴加至上述蛋白质溶液中，用ＮａＯＨ溶液调节ｐＨ值为７．５，搅拌下于温度４℃反应过夜；将混合物离心，取上清，装入透析袋中，透析数天，获得两种无色孔雀石绿－蛋白质溶液，冷冻干燥，在温度－２０℃保存待用；无色孔雀石绿－牛血清白蛋白和无色孔雀石绿－卵清蛋白分别用作免疫原及包被抗原； （３）无色孔雀石绿多克隆抗体的制备 用免疫原免疫两只新西兰大白兔，将１～４ｍｇ免疫原溶于０．５～４ｍＬ的生理盐水中，加入０．５～３ｍＬ完全福氏佐剂，混合成油包水的乳浊 液，每只兔子每次吸取０．５～２．０ｍＬ乳浊液，多点皮下注射入兔子背部，１～５周后，对兔进行第二次免疫，使用不完全福氏佐剂，其余与第一次免疫相同，第二次免疫后，２～５周进行下一次免疫，并且第三次、第四次免疫后，５～７天抽取０．１～０．５ｍＬ耳血，检测抗体产生的情况，第五次免疫后，５～１５天处死兔子，取全血，将血液在冰箱中放置过夜，吸取上层清液，分装，于低温冰箱中储存...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邓安平，贺莉，李大伟，王玉珍，邢玮玮，杨红，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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