【技术实现步骤摘要】
一种新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法及其应用
[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法及其应用。
技术介绍
[0002]硝酸盐天然存在于植源性食物中，已有报道显示各类蔬菜受不同程度的硝酸盐污染，尤其是叶类蔬菜。硝酸盐本身无害或危害性较小，但是在发酵过程或在人体内均可被还原为对人体有害的亚硝酸盐，从而造成亚硝酸盐“二次危害”。利用硝酸盐还原酶降解硝酸盐具有专一高效等优点。目前已报道的硝酸盐还原酶主要来源于植物和细菌，在极端条件下应用受限。嗜盐古菌是一类通常栖息在晒盐场、天然盐湖、腌制品等高盐环境中的微生物，由于其栖息环境的特殊性，嗜盐古菌来源的酶类通常具有耐盐碱、耐高温、耐有机溶剂等特征。嗜盐古菌为寻找广盐性硝酸盐还原酶提供了很好的菌株资源。
[0003]硝酸盐还原酶催化硝酸根还原为亚硝酸根。目前已发表的嗜盐古菌硝酸盐还原酶根据生理功能可分为同化型硝酸盐还原酶(Nas)、异化型硝酸盐还原酶(Nap)和呼吸型硝酸盐还原酶(Nar)。Nas位于细胞质内，便于收集纯化，成为应用领域关注的重点。Nas可分为铁氧还蛋白或黄氧还蛋白依赖性Nas和NADH依赖性Nas。铁氧还蛋白依赖性Nas主要为75～85kDa的单聚体，NADH依赖性Nas主要为异二聚体。
[0004]嗜盐古菌来源的同化型硝酸盐还原酶仅在菌株Haloferax alexandrinus和Haloferax mediterranei中有报道，但是使用的纯化步骤繁琐、得率低。
技术实现思路
>[0005]本专利技术目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种简便的嗜盐古菌(Halorarius litoreus)硝酸盐还原酶(Nas)制备方法及其在腌制蔬菜和污水处理中的应用，本专利技术所用的嗜盐古菌记为Halorarius litoreus BND22
T
。本专利技术涉及的嗜盐古菌硝酸盐还原酶在高温、高盐、碱性等环境下均具有良好的稳定性；Nas的纯化及性能检测为嗜盐古菌硝酸盐还原酶的应用提供基础，为降解腌制蔬菜和污水中的硝酸盐提供新型酶制剂。
[0006]本专利技术的嗜盐古菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC 1.18780；本专利技术基于嗜盐古菌(Halorarius litoreus BND22
T
)的基因组获得一条新型的嗜盐古菌硝酸盐还原酶的基因命名为nas
Hor
，基于nas
Hor
编码的新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶命名为Nas
Hor
，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]本专利技术涉及嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，具体包括以下步骤：
[0008](1)构建重组质粒pTA04
‑
nas
Hor
；
[0009]基于嗜盐古菌(Halorarius litoreus BND22
T
)的全基因组序列进行功能比对，获得一条嗜盐古菌硝酸盐还原酶基因nas
Hor
；然后利用PCR技术扩增目的基因片段nas
Hor
；再通过分子克隆技术将nas
Hor
与pTA04载体相连接，构建得到重组质粒pTA04
‑
nas
Hor
；
10.0下均具有较好的pH稳定性。该酶对Fe
3+
和K
+
具有良好的耐受性；乙醇、甘油和异丙醇对该酶活性具有不同程度的促进作用。当NaNO3为底物时，Nas
Hor
的最大反应速率V
max
为30.94μg/min/mg，动力学常数K
m
为1.64mM。
[0028]本专利技术的优点和技术效果：
[0029](1)本专利技术发现了一条新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶基因，表达出一种新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶，提出了一种新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法。相比已报道的嗜盐古菌硝酸盐还原酶制备方法，该方法纯化步骤更简单，获得的硝酸盐还原酶纯度更高。
[0030](2)Nas
Hor
具有良好的酶学特性，对温度、盐度和pH均具有较优的广适性，对Fe
3+
、K
+
、乙醇、甘油和异丙醇具有不同程度的耐受性。具有优良性状的新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶Nas
Hor
可应用于腌制蔬菜、污水等硝酸盐的降解。
附图说明
[0031]图1为重组质粒双酶切验证图。
[0032]图2为镍柱纯化后Nas
Hor
的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图。
[0033]图3为温度对Nas
Hor
催化活性的影响图。
[0034]图4为NaCl浓度对Nas
Hor
催化活性的影响图。
[0035]图5为pH对Nas
Hor
催化活性的影响图。
[0036]图6为Nas
Hor
在不同温度下的稳定性。
[0037]图7为Nas
Hor
在不同NaCl浓度下的稳定性。
[0038]图8为Nas
Hor
在不同pH下的稳定性。
[0039]图9为不同有机溶剂对Nas
Hor
催化活性的影响图。
[0040]图10为不同金属离子对Nas
Hor
催化活性的影响图。
[0041]图11为Nas
Hor
以硝酸盐为底物的酶动力学曲线图。
具体实施方式
[0042]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0043]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0044]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0045]在不背离本专利技术的范围或精神的情况下，可对本专利技术说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本专利技术的说明书得到的其他实
施方式对技术人员而言是显而易见得的。本专利技术说明书和实施例仅是示例性的。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种新型嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)构建重组质粒pTA04
‑
nas
Hor
；基于嗜盐古菌(Halorarius litoreus BND22
T
)的全基因组序列进行功能比对，获得一条嗜盐古菌硝酸盐还原酶基因nas
Hor
；然后利用PCR技术扩增目的基因片段nas
Hor
；再通过分子克隆技术将nas
Hor
与pTA04载体相连接，构建得到重组质粒pTA04
‑
nas
Hor
；(2)重组质粒pTA04
‑
nas
Hor
转化原核生物宿主并表达；将步骤(1)构建的重组质粒pTA04
‑
nas
Hor
转化原核生物宿主，得到重组细胞接种于Hv
‑
YPC液体培养基中，培养至生长稳定期后进一步离心收集菌体，保存备用；(3)嗜盐古菌硝酸盐还原酶的纯化；收集步骤(2)的菌体于细胞裂解液中重悬，重悬后超声破碎细胞，离心后收集上清液，使用镍柱亲和层析进行纯化，随后通过超滤浓缩酶液，获得高纯度的嗜盐古菌硝酸盐还原酶，记为Nas
Hor
；其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。2.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的嗜盐古菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为CGMCC 1.18780。3.根据权利要求1所述的一种嗜盐古菌硝酸盐还原酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述原核生物宿主是基于菌株Haloferax volcanii，进行突变株的构建，最终获得尿嘧啶胸苷营养缺陷型突变株，记为Haloferax volcanii H1424；所述Haloferax volcanii，购自日本微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为JCM 8879。4.根据权利要求1所述的...
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