非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用制造技术

本发明专利技术公开了非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用，其特征在于：包括以下五个步骤。本发明专利技术分别取人支气管上皮细胞系、人肺上皮细胞系、人正常肝细胞系、人食管癌细胞系和人肺癌细胞系的细胞，进行接种操作，在培养箱中孵育，加入含有青霉素、链霉素和胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基中，并在37℃含二氧化碳培养箱中孵育，对培养箱中孵育培养的细胞进行蛋白质免疫印迹分析和酶联免疫吸附测定,滴入培养箱中孵育中的细胞悬液，过夜待细胞贴壁后，进行免疫荧光反应，进行3D细胞培养，观察并记录一周后的3D细胞生长情况，通过蛋白质免疫印迹分析，检测细胞系所得的各转基因系中YTHDF3的蛋白质表达，集不同的胸部肿瘤的组织样本。集不同的胸部肿瘤的组织样本。集不同的胸部肿瘤的组织样本。

【技术实现步骤摘要】
非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用


[0001]本专利技术涉及的单克隆抗体
，具体为非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用。

技术介绍

[0002]胸水，又名胸腔积液，是临床上常见的病症之一，可因多个疾病引发，在我国，结核是第一位的病因，恶性肿瘤居病因的第二位，不同疾病引发的胸水，其应对措施和患者预后迥然不同，恶性胸水是晚期肿瘤病人常见而又令人苦恼的一种并发症，46％～64％的胸腔积液患者为恶性肿瘤所致，近来有增加的趋势，几乎所有的恶性肿瘤均可引起胸腔积液，在临床上引起胸水的恶性肿瘤中肺癌是占第一位的，其次分别为原发灶不明的胸膜转移性腺癌、乳腺癌，恶性淋巴瘤。
[0003]前者虽然特异性高，但不够敏感，其阳性检出率仅为40％
‑
50％，胸腔镜检查虽可大大提高诊断的敏感性，但因损伤较大、费用高，又有一定的风险，临床应用受限，因此需要使用到非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用，包括以下五个步骤：
[0007]步骤一：所述进行细胞培养，分别取人支气管上皮细胞系、人肺上皮细胞系、人正常肝细胞系、人食管癌细胞系和人肺癌细胞系的细胞，进行接种操作，在培养箱中孵育，并在37℃含二氧化碳培养箱中孵育；
[0008]步骤二：所述免疫荧光反应，对培养箱中孵育培养的细胞进行蛋白质免疫印迹分析和酶联免疫吸附测定,滴入培养箱中孵育中的细胞悬液，过夜待细胞贴壁后，进行免疫荧光反应，观察细胞染色情况并拍摄，准备细胞爬片，将培养箱中孵育培养的细胞消化吹打以后得到的细胞悬液滴入，过夜待细胞贴壁，最后使用激光共聚焦显微镜观察细胞染色情况并进行拍摄；
[0009]步骤三：所述培养观察，取培养箱中孵育中的细胞悬液，进行3D细胞培养，预先在4℃下预冷，然后基底膜提取物和培养基添加培养，每三天更换一次培养基；
[0010]步骤四：所述进行质粒构建，在培养的癌细胞中选择两种，将sgRNA克隆到质粒中，在培养的细胞中选择另外两种，转入质粒，利用基于慢病毒的pLVX质粒，过表达YTHDF3，以产生过表达YTHDF3的细胞系；
[0011]步骤五：所述检测标志物，通过蛋白质免疫印迹分析，检测细胞系所得的各转基因系中YTHDF3的蛋白质表达，集不同的胸部肿瘤的组织样本，检测癌组织和邻近组织之间YTHDF3表达水平的差异，确定m6A RNA甲基化调节因子YTHDF3作为胸部肿瘤检测标志物。
[0012]进一步，所述分别取人支气管上皮细胞系、人肺上皮细胞系、人正常肝细胞系、人食管癌细胞系和人肺癌细胞系的细胞，进行接种操作，在培养箱中孵育，加入含有青霉素、链霉素和胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基中，并在37℃含二氧化碳培养箱中孵育。
[0013]进一步，所述对培养箱中孵育培养的细胞进行蛋白质免疫印迹分析和酶联免疫吸附测定,滴入培养箱中孵育中的细胞悬液，过夜待细胞贴壁后，进行免疫荧光反应，观察细胞染色情况并拍摄，准备细胞爬片，过夜待细胞贴壁，采用兔单克隆抗体滴加在爬片上，在爬片上滴加封片剂，将爬片的细胞面朝下盖到盖玻片上，固定爬片边缘，最后使用激光共聚焦显微镜观察细胞染色情况并进行拍摄。
[0014]进一步，所述取培养箱中孵育中的细胞悬液，进行3D细胞培养，预先在4℃下预冷，然后基底膜提取物和培养基添加培养，观察并记录一周后的3D细胞生长情况，每三天更换一次培养基。
[0015]进一步，所述在培养的癌细胞中选择两种，通过CRISPR/Cas9敲除YTHDF3；再对YTHDF3引物进行退火、消化、与T4连接，将sgRNA克隆到质粒中，在步骤4培养的细胞中选择另外两种，转入质粒，利用基于慢病毒的pLVX质粒，过表达YTHDF3，以产生过表达YTHDF3的细胞系。
[0016]进一步的，所述通过蛋白质免疫印迹分析，检测细胞系所得的各转基因系中YTHDF3的蛋白质表达，集不同的胸部肿瘤的组织样本，检测癌组织和邻近组织之间YTHDF3表达水平的差异，确定m6A RNA甲基化调节因子YTHDF3作为胸部肿瘤检测标志物。
[0017]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：分别取人支气管上皮细胞系、人肺上皮细胞系、人正常肝细胞系、人食管癌细胞系和人肺癌细胞系的细胞，进行接种操作，在培养箱中孵育，加入含有青霉素、链霉素和胎牛血清的高葡萄糖DMEM培养基中，并在37℃含二氧化碳培养箱中孵育，对培养箱中孵育培养的细胞进行蛋白质免疫印迹分析和酶联免疫吸附测定,滴入培养箱中孵育中的细胞悬液，过夜待细胞贴壁后，进行免疫荧光反应，观察细胞染色情况并拍摄，准备细胞爬片，过夜待细胞贴壁，采用兔单克隆抗体滴加在爬片上，在爬片上滴加封片剂，将爬片的细胞面朝下盖到盖玻片上，固定爬片边缘，最后使用激光共聚焦显微镜观察细胞染色情况并进行拍摄，取培养箱中孵育中的细胞悬液，然后基底膜提取物和培养基添加培养，观察并记录一周后的3D细胞生长情况，通过蛋白质免疫印迹分析，检测细胞系所得的各转基因系中YTHDF3的蛋白质表达，集不同的胸部肿瘤的组织样本。
附图说明
[0018]图1为本专利技术的非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用步骤流程示意图。
具体实施方式
[0019]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0020]在本专利技术的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅
是为了便于描述本专利技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本专利技术的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0021]在本专利技术的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本专利技术中的具体含义。
[0022]实施例1
[0023]请参阅图1，本专利技术提供的实施例：非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用，包括以下五个步骤：
[0024]步骤一：所述进行细胞培养，分别取人支气管上皮细胞系、人肺上皮细胞系、人正常肝细胞系、人食管癌细胞系和人肺癌细胞系的细胞，进行接种操作，在培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用，其特征在于：包括以下五个步骤：步骤一：所述进行细胞培养，分别取人支气管上皮细胞系、人肺上皮细胞系、人正常肝细胞系、人食管癌细胞系和人肺癌细胞系的细胞，进行接种操作，在培养箱中孵育，并在37℃含二氧化碳培养箱中孵育；步骤二：所述免疫荧光反应，对培养箱中孵育培养的细胞进行蛋白质免疫印迹分析和酶联免疫吸附测定,滴入培养箱中孵育中的细胞悬液，过夜待细胞贴壁后，进行免疫荧光反应，观察细胞染色情况并拍摄，准备细胞爬片，将培养箱中孵育培养的细胞消化吹打以后得到的细胞悬液滴入，过夜待细胞贴壁，最后使用激光共聚焦显微镜观察细胞染色情况并进行拍摄；步骤三：所述培养观察，取培养箱中孵育中的细胞悬液，进行3D细胞培养，预先在4℃下预冷，然后基底膜提取物和培养基添加培养，每三天更换一次培养基；步骤四：所述进行质粒构建，在培养的癌细胞中选择两种，将sgRNA克隆到质粒中，在培养的细胞中选择另外两种，转入质粒，利用基于慢病毒的pLVX质粒，过表达YTHDF3，以产生过表达YTHDF3的细胞系；步骤五：所述检测标志物，通过蛋白质免疫印迹分析，检测细胞系所得的各转基因系中YTHDF3的蛋白质表达，集不同的胸部肿瘤的组织样本，检测癌组织和邻近组织之间YTHDF3表达水平的差异，确定m6A RNA甲基化调节因子YTHDF3作为胸部肿瘤检测标志物。2.根据权利要求1所述的非小细胞肺癌胸水肿瘤标志物的应用的应用，其特征在于：所述分别取人支气管上皮细胞系、人肺上皮细胞系、人正常肝细胞系、人食管癌细胞系和人肺癌细胞系的细胞，进行接种操作，在培养箱中孵育，加入含有青霉素、链霉素和...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱峻，杰西卡，
申请(专利权)人：深圳市森盈生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：