一种基于微环境响应型上转换荧光生物传感器的水产品中磺胺类兽药残留快速检测方法技术

本发明专利技术属于兽药残留检测技术领域，涉及一种基于微环境响应型上转换荧光生物传感器的水产品中磺胺类兽药残留快速检测方法。步骤为：首先合成上转换纳米材料，在其表面逐步修饰羧基、氨基；将磺胺嘧啶适配体、pH敏感染料异硫氰酸荧光素分别偶联在上转换纳米材料周围的羧基、氨基基团，制备功能化上转换纳米颗粒，构建荧光共振能量转移体系；将磺胺嘧啶适配体互补链与乙酰胆碱酯酶连接制备功能化乙酰胆碱酯酶，与功能化上转换纳米粒子组装，再加入乙酰胆碱溶液，构建特异性检测体系，最后加入磺胺嘧啶标准液，通过测定荧光强度信号建立标准曲线；本发明专利技术实现了磺胺嘧啶的高特异性、灵敏性检测，具有较宽的浓度检测范围和较低的检测限，应用前景良好。应用前景良好。应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】
一种基于微环境响应型上转换荧光生物传感器的水产品中磺胺类兽药残留快速检测方法


[0001]本专利技术属于兽药残留检测
，具体涉及一种基于微环境响应型上转换荧光生物传感器的水产品中磺胺类兽药残留快速检测方法。

技术介绍

[0002]渔业的快速发展使兽药在渔业中的应用日益广泛，兽药在降低动物发病率与死亡率、促进生长、提高饲料利用率和改善产品品质方面的作用十分明显，已成为现代渔业中不可缺少的物质基础。磺胺嘧啶是一种具有代表性的合成磺胺类抗生素，被广泛用作动物治疗过程中的关键药物。然而，磺胺嘧啶残留物可以通过食物链在人体内大量积累，导致过敏反应、肝功能受损、泌尿系统受损和溶血性贫血症状。因此，建立一种快速、灵敏、准确的方法监测水产品中磺胺嘧啶残留具有重要意义。
[0003]磺胺嘧啶的传统检测方法主要包括紫外
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可见光谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和酶联免疫吸附法；这些方法在准确性和可靠性方面具有一定的优势。但由于分析时间长、设备昂贵、人力要求高等原因，限制了其应用，不适合在现场试验中广泛应用。因此需要建立一种更加快速、灵敏、准确的水产品中磺胺嘧啶残留检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决现有技术存在的分析时间长、检测成本高、人力要求高等问题，提供了一种基于微环境响应型上转换荧光生物传感器的水产品中磺胺类兽药残留快速检测方法，利用上转换荧光材料与pH敏感染料异硫氰酸荧光素之间的荧光共振能量转移效应、目标物与适配体间的特异性识别、实现对水产品中磺胺嘧啶残留物的高特异性、灵敏性检测。
[0005]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0006]本专利技术提供一种基于微环境响应型上转换荧光生物传感器的水产品中磺胺类兽药残留快速检测方法，包括以下步骤：
[0007]步骤一，高温热分解法制备上转换荧光纳米材料：将六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化铥加入到甲醇A中超声溶解，再转移至油酸和1
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十八烯的混合溶液中；在氩气保护条件下进行第一次加热搅拌反应，反应结束后冷却至室温，得到冷却液，记为混合溶液A；将氟化铵、氢氧化钠超声溶解于甲醇B中得到混合溶液，在混合溶液中加入混合溶液A进行第二次加热搅拌反应，反应一段时间后继续加热至一定温度挥发甲醇；然后在通入氩气条件下，继续加热到一定温度后稳定一段时间；随后继续升温进行第三次加热搅拌反应，反应后冷却至室温，得到混合溶液B，分离得到反应产物；经清洗、真空干燥后得到上转换纳米材料；
[0008]步骤二，上转换荧光纳米材料表面修饰羧基：将步骤一得到的上转换纳米材料分散于氯仿与甲苯的混合液中，形成混合溶液C，然后在混合溶液C中缓慢加入聚丙烯酸水溶液得到混合溶液D；将混合溶液D在室温避光条件下进行搅拌反应，离心分离得到反应产物；
经清洗、真空干燥，得到羧基修饰的上转换纳米材料；
[0009]步骤三，上转换纳米材料表面嫁接氨基：首先将步骤二得到羧基修饰的上转换纳米材料加入水中，得到羧基修饰的上转换纳米材料的水溶液；将聚丙烯胺盐酸盐加入乙醇中得到聚丙烯胺盐酸盐乙醇溶液，然后在超声作用下将聚丙烯胺盐酸盐乙醇溶液逐滴加入羧基修饰的上转换纳米材料的水溶液中，在室温下避光搅拌反应一定时间，反应后离心得到反应产物，再经离心清洗后进行干燥，获得表面嫁接氨基基团的上转换纳米材料；
[0010]步骤四，上转换纳米材料偶联pH敏感染料异硫氰酸荧光素：将步骤三得到的上转换纳米材料分散于去离子水中，随后加入异硫氰酸荧光素与乙醇的混合溶液，在室温避光条件下，置于摇床上反应一段时间，反应后离心得到反应产物，再经离心清洗后干燥，得到上转换偶联异硫氰酸荧光素纳米材料；
[0011]步骤五，上转换纳米材料连接磺胺嘧啶适配体：将步骤四所得上转换偶联异硫氰酸荧光素纳米材料溶解于4
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吗啉乙磺酸(MES)缓冲液中，再加入1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和N
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羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，在室温下振荡一段时间，随后加入磺胺嘧啶适配体溶液，在室温下继续振荡孵育一段时间；孵育后加入磷酸盐缓冲液离心清洗，得到功能化上转换纳米颗粒，将功能化的上转换纳米颗粒重新分散于磷酸盐缓冲溶液中，得到上转换纳米颗粒分散液，一定温度下保存备用；
[0012]步骤六，乙酰胆碱酯酶连接适配体互补链：分别将EDC溶液和NHS溶液加入乙酰胆碱酯酶稀释液中，随后加入磺胺嘧啶适配体互补链，在室温下振荡孵育一段时间，孵育结束后，在一定温度条件下进行透析，透析后即获得适配体互补链功能化的乙酰胆碱酯酶；
[0013]步骤七，建立特异性检测体系：将步骤六中得到的适配体互补链功能化的乙酰胆碱酯酶与步骤五制备的上转换纳米颗粒分散液按比例混合，经孵育一段时间后，离心清洗，收集清洗后的沉淀物加入一定浓度体积的乙酰胆碱溶液，在室温避光条件下，继续振荡孵育一段时间后得到磺胺嘧啶的特异性检测体系；
[0014]步骤八：建立磺胺嘧啶浓度相关标准曲线：在步骤七中制备得磺胺嘧啶的特异性检测体系中分别加入不同浓度的磺胺嘧啶标准溶液，经孵育后得到不同浓度的检测液，一种浓度的磺胺嘧啶溶液对应一份特异性检测体系，两者为一一对应关系；然后检测加入不同浓度的磺胺嘧啶溶液的特异性检测体系的荧光强度信号特征值，记为Y；建立磺胺嘧啶浓度对数与荧光强度信号特征值的关系，即得到磺胺嘧啶检测标准曲线；
[0015]步骤九：水产品中磺胺嘧啶含量的检测：称取水产样品加入乙腈溶液，经均质、离心后，取上清液在一定水浴温度条件下进行旋转蒸发，经氩气吹干后收集残渣，再将残渣溶解于正己烷中，振荡后再次离心，溶液实现分层，下层为水相；取下层水相加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值，通过步骤八所构建的磺胺嘧啶检测标准曲线，即可计算出水产样品中磺胺嘧啶的含量。
[0016]优选的，步骤一中，所述六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化铥和甲醇A的用量比为241.2mg:77.5mg:1.9mg:10mL；所述甲醇A、油酸、1
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十八烯、氟化铵、氢氧化钠和甲醇B的用量比为10mL:6mL:15mL:0.1482g:0.1g:10mL；所述超声溶解的时间为10min；所述第一次加热搅拌反应，温度为160～170℃，时间为30min。
[0017]优选的，步骤一中，所述第二次加热搅拌的温度为45～50℃，时间为30～40min；所述继续加热至一定温度挥发甲醇的温度为65～70℃，时间为40～50min；所述在通入氩气条
件下加热到一定温度为100℃，稳定一段时间为10～15min，继续升温进行第三次加热搅拌反应的温度为290～300℃，搅拌反应的时间为60～90min。
[0018]优选的，步骤二中，所述混合溶液C中上转换荧光纳米材料的浓度为5mg/mL；所述混合溶液C中氯仿与甲苯的体积比为2:3：所述聚丙烯酸水溶液浓度为25本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于微环境响应型上转换荧光生物传感器的水产品中磺胺类兽药残留的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，将六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化铥加入到甲醇A中超声溶解，再转移至油酸和1
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十八烯的混合溶液中；在氩气保护条件下进行第一次加热搅拌反应，反应结束后冷却至室温，得到冷却液，记为混合溶液A；将氟化铵、氢氧化钠超声溶解于甲醇B中得到混合溶液，在混合溶液中加入混合溶液A进行第二次加热搅拌反应，反应一段时间后继续加热至一定温度挥发甲醇；然后在通入氩气条件下，继续加热到一定温度后稳定一段时间；随后继续升温进行第三次加热搅拌反应，反应后冷却至室温，得到混合溶液B，分离得到反应产物；经清洗、真空干燥后得到上转换纳米材料；步骤二，将步骤一得到的上转换纳米材料分散于氯仿与甲苯的混合液中，形成混合溶液C，然后在混合溶液C中缓慢加入聚丙烯酸水溶液得到混合溶液D；将混合溶液D在室温避光条件下进行搅拌反应，离心分离得到反应产物；经清洗、真空干燥，得到羧基修饰的上转换纳米材料；步骤三，首先将步骤二得到羧基修饰的上转换纳米材料加入水中，得到羧基修饰的上转换纳米材料的水溶液；将聚丙烯胺盐酸盐加入乙醇中得到聚丙烯胺盐酸盐乙醇溶液，然后在超声作用下将聚丙烯胺盐酸盐乙醇溶液逐滴加入羧基修饰的上转换纳米材料的水溶液中，在室温下避光搅拌反应一定时间，反应后离心得到反应产物，再经离心清洗后进行干燥，获得表面嫁接氨基基团的上转换纳米材料；步骤四，将步骤三得到的上转换纳米材料分散于去离子水中，随后加入异硫氰酸荧光素与乙醇的混合溶液，在室温避光条件下，置于摇床上反应一段时间，反应后离心得到反应产物，再经离心清洗后干燥，得到上转换偶联异硫氰酸荧光素纳米材料；步骤五，将步骤四所得上转换偶联异硫氰酸荧光素纳米材料溶解于4
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吗啉乙磺酸缓冲液中，再加入1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N
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羟基琥珀酰亚胺溶液，在室温下振荡一段时间，随后加入磺胺嘧啶适配体溶液，在室温下继续振荡孵育一段时间；孵育后加入磷酸盐缓冲液离心清洗，得到功能化上转换纳米颗粒，将功能化的上转换纳米颗粒重新分散于磷酸盐缓冲溶液中，得到上转换纳米颗粒分散液，一定温度下保存备用；步骤六，分别将EDC溶液和NHS溶液加入乙酰胆碱酯酶稀释液中，随后加入磺胺嘧啶适配体互补链，在室温下振荡孵育一段时间，孵育结束后，在一定温度条件下进行透析，透析后即获得适配体互补链功能化的乙酰胆碱酯酶；步骤七，将步骤六中得到的适配体互补链功能化的乙酰胆碱酯酶与步骤五制备的上转换纳米颗粒分散液按比例混合，经孵育一段时间后，离心清洗，收集清洗后的沉淀物加入一定浓度体积的乙酰胆碱溶液，在室温避光条件下，继续振荡孵育一段时间后得到磺胺嘧啶的特异性检测体系；步骤八：在步骤七中制备得磺胺嘧啶的特异性检测体系中分别加入不同浓度的磺胺嘧啶标准溶液，经孵育后得到不同浓度的检测液，一种浓度的磺胺嘧啶溶液对应一份特异性检测体系，两者为一一对应关系；然后检测加入不同浓度的磺胺嘧啶溶液的特异性检测体系的荧光强度信号特征值，记为Y；建立磺胺嘧啶浓度对数与荧光强度信号特征值的关系，即得到磺胺嘧啶检测标准曲线；步骤九：水产品中磺胺嘧啶含量的检测：称取水产样品加入乙腈溶液，经均质、离心后，
取上清液在一定水浴温度条件下进行旋转蒸发，经氩气吹干后收集残渣，再将残渣溶解于正己烷中，振荡后再次离心，溶液实现分层，下层为水相；取下层水相加入到特异性检测体系中，测定特异性检测体系的荧光强度信号特征值，通过步骤八所构建的磺胺嘧啶检测标准曲线，即可计算出水产样品中磺胺嘧啶的含量。2.根据权利要求1所述的一种基于微环境响应型上转换荧光生物传感器的水产品中磺胺类兽药残留快速检测方法，其特征在于，步骤一中，所述六水氯化钇、六水氯化镱、六水氯化铥和甲醇A的用量比为241.2mg:77.5mg:1.9mg:10mL；所述甲醇A、油酸、1
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十八烯、氟化铵、氢氧化钠和甲醇B的用量比为10mL:6mL:15mL:0.1482g:0.1g:10mL；所述超声溶解的时间为10min；所述第一次加热搅拌反应，温度为160～170℃，时间为30min；所述第二次加热搅拌的温度为45～50℃，时间为30～40min；所述继续加热至一定温度挥发甲醇的温度为65～70℃，时间为40～50min；所述在通入氩气条件下加热到一定温度为100℃，稳定一段时间为10～15min，继续升温进行第三次加热搅拌反应的温度为290～300℃，搅拌反应的时间为60～90min。3.根据权利要求1所述的一种基于微环境响应型上转换荧光生物传感器的水产品中磺胺类兽药残留快速检测方法，其特征在于，步骤二中，所述混合溶液C中上转换荧光纳米材料的浓度为5mg/mL；所述混合溶液C中氯仿与甲苯的体积比为2:...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈全胜，吴雯雯，欧阳琴，吴继忠，丁小丹，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：