一种对细胞凋亡双通道检测的荧光探针及制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种对细胞凋亡双通道检测的荧光探针及制备方法和用途，其中对细胞凋亡双通道检测的荧光探针的结构如下：。本发明专利技术对细胞凋亡双通道检测的荧光探针，在体外实验中表现出对粘度及H2O2的良好响应性且互不干扰。细胞毒性测试表明该荧光探针的较低的生物毒性，适用于在不同通道荧光成像细胞内的粘度及H2O2的变化，适用于对细胞凋亡进行检测。用于对细胞凋亡进行检测。用于对细胞凋亡进行检测。

【技术实现步骤摘要】
一种对细胞凋亡双通道检测的荧光探针及制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及一种对细胞凋亡双通道检测的荧光探针及制备方法和用途，以实现在不同通道荧光成像检测细胞内的粘度和H2O2的变化，具有高选择性、高灵敏度、低生物毒性的优点。

技术介绍

[0002]粘度是影响生物过程的主要参数之一，它决定了物质的迁移率和扩散控制反应的速率。在细胞内水平上，强烈影响细胞的动态变化，如信号转导、生物大分子之间的相互作用、代谢和凋亡。粘度的异常会影响细胞内部复杂的系统平衡，导致基于粘度扩散的小分子和pH的扰动，以及细胞器的破坏和机体功能障碍。更严重的粘度异常会引起炎症、脂肪肝、阿尔茨海默病、帕金森综合征等严重疾病。实现细胞黏度的实时原位成像，对梳理黏度相关的生物和病理功能具有重要意义。
[0003]活性氧是主要在线粒体中产生的含氧高活性分子、离子或自由基。主要包括过氧化氢、单线态氧、超氧化物、羟基自由基等。H2O2作为活性氧的关键成员，对许多生理过程具有一定的调节作用。但是，H2O2的异常产生会引起癌症，阿尔茨海默氏病，心血管疾病等疾病。因此，开发一种简单有效的检测H2O2和粘度的荧光探针具有重要意义。
[0004]细胞凋亡，即细胞程序性死亡，是机体内嵌的一种防御机制，在机体的正常发育和抗病过程中起着重要作用。异常的凋亡过程和通路可导致多种疾病，包括癌症。根据以前的报道，细胞凋亡与粘度和H2O2之间确实存在一定关系。因此，开发一种简单有效的活细胞中粘度和H2O2的监测工具用于监测细胞凋亡具有重要意义。
[0005]2020年6月9日中国专利CN2019113435790公开了一种双通道检测极性和粘度的双光子荧光探针及其制备方法，可以同时在两个不同通道监测细胞线粒体中极性和粘度的实时变化。
[0006]荧光成像由于其独特的优点，如简单、高灵敏度和无创可视化特征，被认为是检测和追踪生命系统中物质的最通用的方法之一。荧光小分子探针具有渗透性高、特异性强、稳定、毒性低以及可用于细胞实时成像等优点，逐渐成为检测细胞微环境和信号分子的优良工具。开发有效适用于检测生物样品中粘度和H2O2水平的优良探针并用于监测细胞凋亡尤为重要。作为本领域技术人员，亟待开发一种对细胞凋亡双通道检测的荧光探针及制备方法。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在提供一种对细胞凋亡双通道检测的荧光探针的设计及其研究，所要解决的技术问题是通过分子设计得到具有可以分别响应粘度和H2O2的有机小分子结构，以实现通过荧光成像在不同通道实时监测活细胞内粘度和H2O2的变化，具有选择性高、灵敏度高等优点，细胞毒性测试表明本专利技术荧光探针的细胞相容性良好。
[0008]本专利技术对细胞凋亡的双通道检测的荧光探针，以下简记为Probe
‑
ZW，其结构式如
下所示：
[0009]本专利技术对细胞凋亡双通道检测的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：步骤1：将4
‑
二苯胺苯甲醛(0.00366mol，1g)溶解在甲醇中，在室温下搅拌反应混合物，向该溶液中加入3
‑
吡啶乙腈(0.00549mol，0.648g)和甲醇钠(0.00519mol，0.28g)。在60℃搅拌反应混合物2小时，将反应混合物冷却至室温。将混合物倒入水中，用CH2Cl2(30mL)萃取3次，有机层用无水Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物。随后用二氯甲烷溶解，通过薄层色谱法纯化产物，柱层析的展开剂极性选择为石油醚：二氯甲烷＝10:1，v:v，对产物提取分离并收集到黄色的固体中间化合物，以下简称为ZW
‑
1，产率为69％。
[0010]步骤2：将化合物ZW
‑
1(0.001mol，0.373g)、4
‑
溴甲基苯硼酸频哪醇酯(0.001mol，0.297g)、K2CO3(0.0007mol，0.1g)溶解在乙腈中。在70℃搅拌反应混合物2小时，TLC观察至反应结束后，以体积比为1:50的甲醇和二氯甲烷作为展开剂，经柱层析分离纯化产物，最终收集到红色的固体Probe
‑
ZW，产率为56％。
[0011]本专利技术对细胞凋亡双通道检测的荧光探针的合成路线如下所示：
[0012]本专利技术对细胞凋亡双通道检测的荧光探针，其机理如图9所示。在低粘度体系中，转子可以自由转动，从而在一定程度上抑制了荧光发射。在高粘度体系中，转子的转动受到抑制，能量只能以荧光的形式释放。硼酸盐作为H2O2的反应位点，探针Probe
‑
ZW与H2O2反应后，回到化合物ZW
‑
1的结构，由于ICT效应，开启荧光。
[0013]本专利技术对细胞凋亡双通道检测的荧光探针的应用，是在检测活细胞内的粘度和
H2O2变化时作为检测试剂使用，是以非治疗或诊断为目的。检测方法如下：将本专利技术Probe
‑
ZW溶于DMSO(5mL)中制得2mM的母液，取15μLProbe
‑
ZW母液加入到3mL不同配比的甲醇/甘油体系混合溶剂中，得到最终浓度为10μM的测试液。Probe
‑
ZW的单光子激发波长为365nm，检测400
‑
500nm范围内的荧光光谱变化，可以明显观察到412nm处荧光发射波长的强度随着溶剂粘度的增加而增加(粘度由甲醇的粘度0.59cP增至945.5cP甘油的粘度)，最高粘度时的荧光强度约为粘度最低时荧光强度的17倍，溶液粘度和荧光强度呈现良好的线性关系(R2＝0.9992)。
[0014]为了测试Probe
‑
ZW对于H2O2的响应情况，取15μLProbe
‑
ZW母液加入到不同体积的H2O2溶液，用缓冲液稀释至终体积为3mL，得到最终浓度为10μM的测试液。单光子激发波长同上，检测500
‑
700nm范围内的荧光光谱变化，可以观察到样品的荧光强度随着H2O2浓度的增加逐渐增强，Probe
‑
ZW的荧光强度和H2O2浓度之间呈正相关且具有良好的线性关系(R2＝0.9978)。同时也排除了一些氨基酸及各种离子对探针Probe
‑
ZW荧光的干扰，从而证明探针Probe
‑
ZW对H2O2的特异性响应。此外，还探究了Probe
‑
ZW在HeLa细胞中的光学稳定性，利用Probe
‑
ZW对细胞内粘度及H2O2实现双检测。本专利技术具有以下有益效果：
[0015]本专利技术对细胞凋亡的双通道检测的荧光探针，在溶液和细胞中对粘度和H2O2良好响应能力。细胞毒性测试表明Probe
‑
ZW的细胞相容性良好，荧光显微成像实验表明Probe
‑
ZW可以有效实现对细胞内粘度及H2O2双检测，可以检测出内源性和外源性H2O2的变化，也可以检测肿瘤细胞黏度的变化。同时用依托泊苷诱导的细胞凋亡模型，通过对粘度和H2O2的双检测，实现本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对细胞凋亡双通道检测的荧光探针，其特征在于，其结构式为：。2.一种如权利要求1所述的对细胞凋亡双通道检测的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将4
‑
二苯胺苯甲醛1g溶解在甲醇中，在室温下搅拌反应混合物，向该溶液中加入3
‑
吡啶乙腈0.648g和甲醇钠0.28g，在60℃搅拌反应混合物2小时，将反应混合物冷却至室温，将混合物倒入水中，用CH2Cl230mL萃取3次，有机层用无水Na2SO4干燥并浓缩，得到粗产物，再经色谱柱分离纯化得中间化合物；步骤2：将化合物中间化合物10.373g、4
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟祥明，张宛雏，黄富豪，徐雨，李瑜宸，陈瑾慧，冯燕，
申请(专利权)人：安徽大学，
类型：发明
国别省市：