一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法技术

本发明专利技术涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，包括如下步骤：S1：外植体消毒；S2：诱导愈伤组织的外植体筛选；S3：愈伤组织诱导分化培养基筛选；S4：愈伤组织再生培养基筛选；S5：愈伤组织种类和继代时间筛选。本发明专利技术通过优化小花灯心草诱导、分化、再生不同阶段的条件，首次成功建立了采用成熟种子和无菌苗产生的胚根和根尖两种外植体的小花灯心草高效稳定的再生体系。高效、快速的组培再生体系的建立，为小花灯心草的种质资源的创新研究和功能基因的调控机理研究奠定了坚实的基础。控机理研究奠定了坚实的基础。控机理研究奠定了坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】
一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法


[0001]本专利技术涉及植物组织培养
，特别涉及一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法。

技术介绍

[0002]小花灯心草(Juncus articulatus Linn.2n＝80)是灯心草科(Juncaceae)灯心草属(Juncus)的多年生草本植物，在我国的山东、江苏、浙江、安徽、江西、湖南、湖北、福建、贵州、四川、广东、广西、云南、海南、西藏、台湾等地区均有分布[1]，在亚洲北部、欧洲、北美洲及非洲也有分布。作为一种湿生植物，小花灯心草主要生于海拔1200
‑
3680m的溪边、水边、湿地、沼泽、湿地、疏林草地及稻田旁，但在不同生境中，形态特征存在较大变异。
[0003]灯心草属在我国共有属植物77种，10变种以及1亚种，多数属于纤维植物，可用于园林绿化，可作为牲畜饲草，少数还可供药用，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、催眠镇静等多种药理作用，具有较好的药品开发前景。小花灯心草根系发达，具有很强的抗污能力，能够在富营养化、重金属污染水体中正常生长，可以大量吸收水中过剩的氮、磷和钾等营养盐用于自身生长，还能有效地吸附富集铜、铅、镉等重金属，具有较好的去除效果。
[0004]小花灯心草是黑河中游盐碱化沼泽的植被之一。随着植物生态修复和人工湿地技术的发展应用，常被作为湿地的观赏绿植，应用于人工湿地生态系统中，同时发挥观赏和水质净化、重金属污水吸附处理的重要作用。小花灯心草作为湿生植物根系发达，叶片绿色筒状，是研究植物生态修复和禾本科单面叶发育形态发生的重要材料。
[0005]目前，国内外对灯心草属植物的研究较少，且主要集中在药用价值考证、重金属积累的生理特性和单面叶发育形态发生等方面，关于灯心草属植物组织培养的研究尚未见报道，更未有小花灯心草组织培养再生体系建立的报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对小花灯心草的植物组织培养再生体系建立，以小花灯心草的成熟种子为外植体，比较分析了不同灭菌方式、外植体类型、培养基及植物生长调节剂对愈伤组织诱导、分化和植株再生的影响，提供了一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，建立并优化了小花灯心草的组织培养再生体系。
[0007]一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，包括如下步骤：
[0008]S1：外植体消毒；
[0009]S2：诱导愈伤组织的外植体筛选；
[0010]S3：愈伤组织诱导分化培养基筛选；
[0011]S4：愈伤组织再生培养基筛选；
[0012]S5：愈伤组织种类和继代时间筛选。
[0013]在上述技术方案基础上，所述步骤S1中将小花灯心草种子进行消毒处理，消毒处理的方法为A 30％ NaClO消毒15
‑
30min或方法B 75％乙醇消毒30s，10％
‑
30％ NaClO消毒
15
‑
30min中的任意一种。
[0014]在上述技术方案基础上，所述步骤S1在种子消毒处理前使用4％烟熏液进行种子破除休眠处理，提高出愈伤率，缩短诱导愈伤组织的时间。
[0015]在上述技术方案基础上，所述步骤S2中，诱导愈伤组织使用的外植体为S1处理得到的种子或S1处理得到的种子经培养所得的无菌幼苗的胚根和根尖。
[0016]在上述技术方案基础上，所述步骤S3中愈伤组织诱导培养基为以下浓度的组分：MS+2,4
‑
D 2.0
‑
5.0mg/L+6
‑
BA 0.6mg/L，得到三类愈伤组织。
[0017]在上述技术方案基础上，所述三类愈伤组织，Ⅰ类为黄色颗粒且硬实度高、Ⅱ类黄色颗粒但松软、Ⅲ类白色或略褐色且松软。
[0018]在上述技术方案基础上，所述步骤S4中愈伤组织再生培养基为以下浓度的组分：MS+KT 1.0
‑
2.0mg/L+NAA 0
‑
2.0mg/L，再生培养4
‑
5周，得到不定芽。
[0019]在上述技术方案基础上，所述步骤S5中继代Ⅰ类愈伤组织，再生率90％以上。
[0020]在上述技术方案基础上，所述步骤S5中愈伤组织每4周继代一次，继代培养4
‑
36周的愈伤组织均可最为再生/遗传转化的材料。
[0021]在上述技术方案基础上，S4中再生培养和S5中继代培养的条件如下：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5500
‑
8000Lux，恒温28℃。
[0022]本专利技术具有如下优点：
[0023]本专利技术通过优化小花灯心草诱导、分化、再生不同阶段的条件，首次成功建立了采用成熟种子和无菌苗产生的胚根和根尖两种外植体的小花灯心草高效稳定的再生体系。高效、快速的组培再生体系的建立，为小花灯心草的种质资源的创新研究和功能基因的调控机理研究奠定了坚实的基础。
附图说明
[0024]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一种实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0025]图1：本专利技术植物材料小花灯心草的形态特征，A为植株形态，B为叶片形态，C为蒴果和种子形态；
[0026]图2：本专利技术不同外植体类型对诱导率和成愈率的影响，A为成熟种子做外植体，B为无菌苗产生的胚根和根尖做外植体，C为不同时间的诱导率，D为不同时间的成愈率；
[0027]图3：不同愈伤组织状态对再生的影响，ABC为Ⅰ类愈伤组织及再生，DEF为Ⅱ类愈伤组织及再生，HIJ为Ⅲ类愈伤组织及再生；
[0028]图4：愈伤组织年龄对再生的影响，A为基因型1的再生率和褐化率，B为基因型2的再生率和褐化率，C为基因型3的再生率和褐化率，D为不同基因型培养36周的愈伤组织状态，E为不同基因型培养48周的愈伤组织状态。
具体实施方式
[0029]下面结合附图、实验和实验数据对本专利技术作进一步说明：
[0030]植物材料：
[0031]小花灯心草(Juncus articulatus Linn.)采集于山东省滨州市，须根发达，具根状茎和匍匐茎，节上生有不定根；直立茎部分高10
‑
25cm，直径1
‑
2mm，绿色且光滑无毛，可产生2
‑
4个分蘖(图1
‑
A)；叶多为茎生，圆筒形，绿色，具有5
‑
10个明显的横隔，叶长6
‑
12cm，宽0.7
‑
3mm(图1
‑
B)；花序具有3
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9个分头，花序梗长短不等，蒴果三棱状圆锥形；种子长卵形，极小，长0.4
‑
0.5mm，两端具有小尖头，蜡黄色，表面具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：外植体消毒；S2：诱导愈伤组织的外植体筛选；S3：愈伤组织诱导分化培养基筛选；S4：愈伤组织再生培养基筛选；S5：愈伤组织种类和继代时间筛选。2.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤S1中将小花灯心草种子进行消毒处理，消毒处理的方法为A 30％NaClO消毒15
‑
30min或方法B 75％乙醇消毒30s，10％
‑
30％NaClO消毒15
‑
30min中的任意一种。3.根据权利要求2所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤S1在种子消毒处理前使用4％烟熏液进行种子破除休眠处理。4.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤S2中，诱导愈伤组织使用的外植体为S1处理得到的种子或S1处理得到的种子经培养所得的无菌幼苗的胚根和根尖。5.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤S3中愈伤组织诱导培养基为以下浓度的组分：MS+2,4
‑
D 2.0
‑
5.0mg/L+6
...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴雪莉，王增裕，孙娟，杨国锋，熊王丹，姜凯，胡晓辰，卢文杰，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：