一种检测生殖细胞－支持细胞共培养细胞凋亡的方法技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及生殖细胞－支持细胞共培养的细胞凋亡检测方法。本发明专利技术采用在培养皿中对短期共培养生殖细胞和支持细胞进行直接ＴＵＮＥＬ染色，染毒，检测共培养中整体细胞凋亡情况。本发明专利技术在培养皿中直接进行ＴＵＮＥＬ染色，可保持生殖细胞－支持细胞共培养形态，准确地反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征；同时不需要细胞爬片涂片等需要相应技术的过程，提高了实验的成功率。本发明专利技术可用于利用生殖细胞－支持细胞共培养系观察化学物的急性生殖毒性和细胞凋亡。经实验验证，方法可信。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及检测细胞凋亡的方法，具体涉及一种生殖细胞-支 持细胞共培养的细胞凋亡检测方法。
技术介绍
睾丸生殖细胞和支持细胞共培养系由于模拟了体内过程，并能提高生殖细胞的存 活率和促进生殖细胞的增殖生长，常用于对生殖细胞发育分化过程的研究，和培养生殖细 胞用于移植。目前，利用该培养系探讨化学物的生殖毒性研究尚处于开始阶段。在探讨化学物毒性时，化学物对细胞凋亡的影响是常用指标。现有技术检测化学 物毒性的方法中，其中染色体荧光染色法尽管简便，但标本不宜保存；用脱氧核糖核苷酸末 端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)，只要DNA双链断裂或链上出现缺口，即可在末端 转移酶(TdT)的作用下被标记，其灵敏度高，不需大型仪器，是目前探测细胞凋亡的常用方 法。现有技术对培养细胞用TUNEL法时，细胞处理不外乎分为两种情况，一是对贴壁 细胞采取细胞爬片，二是对悬浮细胞采取收集细胞后涂片。但是，有研究报道，在观察大鼠 睾丸生殖细胞_支持细胞共培养系的细胞凋亡时，由于共培养体系中既有贴壁的支持细胞 又有悬浮的生殖细胞，给一般的观察方法带来了困难。同时由于共培养系中生殖细胞和支 持细胞互相共存，收集细胞和爬片涂片将不能观察其整体凋亡情况。目前尚没有发现用 TUNEL法探测大鼠睾丸生殖细胞-支持细胞共培养中的细胞凋亡的报道。为此，本专利技术拟探 索短期培养，直接在培养皿中对共培养细胞系进行TUNEL染色的方法。
技术实现思路
本专利技术是的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测细胞凋亡的方法，具体涉 及一种生殖细胞_支持细胞共培养的细胞凋亡检测方法。本专利技术采用在培养皿中对短期共培养生殖细胞和支持细胞进行直接TUNEL染色， 检测共培养中整体细胞凋亡情况。具体而言，本专利技术提供的生殖细胞_支持细胞共培养的细胞凋亡检测方法，其特 征是通过原代分离大鼠雄性睾丸生殖细胞和支持细胞，在培养皿中对生殖细胞和支持细 胞共培养，染毒，直接在培养皿中用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法 (TUNEL)观察共培养系的细胞凋亡情况，其包括下述步骤(1)大鼠雄性生殖细胞、支持细胞原代分离，培养皿中培养(2)细胞凋亡染色和观察本专利技术中，所述步骤1)，实验动物生殖细胞、支持细胞分离培养为取新生雄性大鼠，常规处理后消毒，无菌条件下快速取两侧睾丸，置于盛有HBSS 的小皿中，HBSS清洗后移入离心管，加入含100μ g/mLDNAaSe、0. 胶原酶和0. 透明质 酸酶的DMEM液作用20min ；离心去上清，再加入含100 μ g/mLDNAase、0. 1 %胶原酶的DMEM3液作用30min，离心去上清，加DMEM液放置冰浴后吸出上清，加胰酶吹打，显微镜下观察生 精小管成单个的细胞后加入2 % FBS终止消化，离心去上清，加入新鲜培养液，制成单细胞 悬液用于细胞培养；将细胞接种明胶铺面的培养皿中，置于5% C02、95%空气饱和湿度培 养箱中培养。本专利技术中，所述步骤2)细胞凋亡染色和观察为细胞处理在培养皿中，无需取出，按所定时间培养后，吸出培养液，用4%多聚甲 醛固定细胞，固定Ih ；按照TUNEL试剂盒(市购)所示操作。实验结果显示1.在不同的培养温度和不同培养时间下TUNEL染色细胞凋亡和预期一致。比较33°C培养2h，41°C培养2h和41°C培养14h的细胞凋亡情况，结果表明，41°C 培养2h组和14h组所得凋亡的发生率均明显高于33°C培养2h组，经χ 2检验其差异有统 计学意义。2.在不同浓度镉暴露条件下TUNEL染色细胞凋亡的表现和预期一致。在培养系培养24小时使生殖细胞完全贴壁后，加入不同浓度镉(0，2. 5，5，10 μ m) 培养12小时观察细胞凋亡。结果显示，除了生殖细胞和支持细胞凋亡图像外，尚有支持细 胞吞噬凋亡细胞图像(见图3)。本专利技术利用生殖细胞_支持细胞共培养系观察化学物的急性生殖毒性和细胞凋 亡，能克服在常规方法中收集细胞所引起的细胞形态改变的缺陷，可保持生殖细胞-支持 细胞不同形态共培养时的状态进行TUNEL染色，从而准确的反应细胞凋亡最典型的生物化 学和形态特征；同时不需要细胞爬片涂片等需要相应技术的过程，提高了实验的成功率。附图说明图1是共培养的支持细胞与生殖细胞生长情况其中显示，培养2h，支持细胞开始贴壁，生殖细胞呈悬浮状；培养14h，可见多数支 持细胞贴壁，生殖细胞贴附于支持细胞。(图2为不同的培养温度和不同培养时间下TUNEL染色所示细胞凋亡图。图3是培养24小时染毒镉12小时后的细胞凋亡图‘其中显示，除了生殖细胞和支持细胞凋亡图像外，尚有支持细胞吞噬凋亡细胞图 像。具体实施例方式实施例11.实验动物生殖细胞、支持细胞分离培养取生后新生雄性大鼠，常规处理后75%乙醇消毒，无菌条件下快速取两侧睾丸， 置于盛有HBSS的小皿中，解剖镜下仔细去除每个睾丸的脂肪组织、附睾、睾丸被膜及血管， HBSS清洗后移入15ml的离心管，加入相当于组织体积10倍的含100 μ g/mLDNAaSe、0. 1% 胶原酶和0. 透明质酸酶的DMEM液作用20min。离心去上清，再加入含100μ g/mLDNAase、 0. 胶原酶的DMEM液作用30min，离心去上清，加DMEM液放置冰浴15min后吸出上清，加 胰酶吹打，至显微镜下观察生精小管成单个的细胞后加入2% FBS终止消化，离心去上清，加入2ml新鲜培养液(DMEM+丙酮酸钠+非必需氨基酸+乳酸钠+抗生素+转铁蛋白+LIF) 制成单细胞悬液用于细胞培养。将细胞接种于已用明胶铺面的培养皿中，细胞接种密度为 70-80%，置于5% C02、95%空气饱和湿度培养箱中培养。2.细胞凋亡染色和观察细胞处理在培养皿中，无需取出，按所定时间培养后，吸出培养液，用4%多聚甲 醛固定细胞，固定lh。按照TUNEL试剂盒所示，吸去固定液，加PBS洗2次；加3% H20室 温孵育IOmin ；用PBS洗2次；加入含TdT和DIG-d-UTP的标记缓冲液(试剂阴性对照加不 含TdT酶的反应液)，将培养皿置于湿盒中，于37°C标记2小时；TBS液洗2次后加封闭液， 室温孵育30min ；吸去封闭液，不洗加1 100生物素化抗地高辛抗体稀释液50 μ L于标记 区域，将培养皿置于湿盒中，37°C反应30min ；用TBS洗2次后加1 100SABC抗体稀释液 50 μ L于标记区域，将培养皿置于湿盒中，37°C反应30min ；用TBS洗4次；加DAB显色液显 色至培养皿中的液体变为棕色(约15min)，蒸馏水洗，不吸，倒置显微镜下观察。实验结果显示1，在不同的培养温度和不同培养时间下TUNEL染色细胞凋亡和预期一致。据文献报道支持细胞、精原细胞共培养在33°C培养2h细胞凋亡发生率不超过 2%，而在41°C培养将发生明显凋亡，因此本专利技术比较了 33°C培养2h，41°C培养2h和41°C 培养14h的细胞凋亡情况。结果表明，41°C培养2h组和14h组所得凋亡的发生率均明显高 于33°C培养2h组，经χ 2检验其差异有统计学意义。表1为单盲法在标记染色的区域内选3个视野(每组均选择同一位置的视野)并 计数每个视野的凋亡细胞和总细胞数(每个视野至少100个细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测化学物诱导生殖细胞－支持细胞共培养细胞凋亡的方法，其特征是通过原代分离大鼠雄性睾丸生殖细胞和支持细胞，在培养皿中对生殖细胞和支持细胞共培养，染毒，直接在培养皿中用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法观察共培养系的细胞凋亡情况；其包括下述步骤：　　（１）实验动物生殖细胞、支持细胞原代分离，培养皿中培养；　　（２）细胞凋亡染色和观察。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴庆，赖纯米，李克勇，常秀丽，周志俊，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]