本发明专利技术公开了一株芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＥＣＵ００１５，保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２８７４。以该菌株的静息细胞及生长细胞为生物催化剂，催化苯乙二醇环碳酸酯、乙酰扁桃酸及其衍生物不对称水解，制备获得光学活性的手性苯乙二醇和扁桃酸等手性化合物。本发明专利技术所述的菌种立体选择性高，生物转化工艺简单、安全，成本低廉，环境友好，而且产物容易纯化，具有工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工领域，涉及一株芽孢杆菌及其用于转化苯乙二醇环碳酸 酯、乙酰扁桃酸等化合物获取光学纯手性化合物的方法。
技术介绍
手性化合物是目前生物催化的重要产品，主要应用于制药等领域。光学纯手 性二醇及其环碳酸酯作为重要的手性中间体，有着广泛的应用，其合成制备越来越受到重视。例如，cs)-苯乙二醇可以作为液晶材料的手性添加剂，用于縮短液晶面板的响应时间；(及)-对硝基苯乙二醇和(5)-3-氯-1,2-丙二醇是心血管药物|5-阻滞剂的手性中间体；(i )-碳酸丙烯酯和(7S,2/ )-茚满二醇分别是逆转录酶抑制剂 和蛋白酶抑制剂合成的手性中间体。近年来不少企业与研究小组都投入极大的热 情研究这些手性化合物的合成新技术。已知的手性二醇合成方法有化学法和生物法。化学法包括利用有机金属催 化剂催化烯烃的不对称双羟基化、环氧化物的选择性水解或手性羟基酸的选择性 还原等；生物法则包括双加氧酶催化的烯烃不对称双羟基化、环氧水解酶催化的 环氧化物对映选择性水解、酯水解酶催化的二醇羧酸酯的选择性水解以及氧化还 原酶催化的二醇选择性氧化或相应酮的选择性还原等。手性环碳酸酯的化学合成 报道较多的是采用间接的方法先合成手性二醇或环氧化物，然后进一步合成手 性环碳酸酯；近年来也有利用环氧化物的不对称羰基化反应直接合成手性环碳酸 酯的报道，但产物的光学纯度较低(最高为70%)。从原料特点和来源看，化学法合成环碳酸酯可由二氧化碳与相应的环氧化物 制得，目前国内碳酸丙烯酯等已经成功地实现了大吨位合成，原料来源非常丰富；与其它羧酸酯相比，环碳酸酯水解产生的二氧化碳避免了有机酸对设备的腐蚀和 对环境的污染。结合生物催化反应温和、选择性高的特点，环碳酸酯水解酶催化 的环碳酸酯立体选择性水解将是手性环碳酸酯和手性二醇合成的绿色新方法。目前，环碳酸酯水解酶催化环碳酸酯的立体选择性水解在国际上属于一个较新的研究领域，在很多方面的工作都处于刚刚起步的阶段。从酶的来源看，种类 较少，多为动物来源，研究内容涉及酶的纯化、表征和二级结构，利用其催化环 碳酸酯对映选择性拆分的研究很少，结果也不是很理想(Yang Y丄.，Ramaswamy S.， and Jakoby M^.B. Enzymatic hydrolysis of organic cyclic carbonates. / 5/o/. CTzem. 1998,273: 7814-7817)，微生物来源的环碳酸酯水解酶仅限于日本学者的个别报 道，其研究对象局限在一端为甲基的双取代的环碳酸酯(Matsumoto K, Sato Y, Shimojo M and Hatanaka M. Highly enantioselective preparation of C2-symmetrical diols: microbial hydrolysis of cyclic carbonates. 7^raAedraw: y4砂w附e/^. 2000， 11: 1965-1973)，在微生物的筛选方面还有很大的可开发空间。在底物谱的研究方面， 多集中在长链脂肪族环碳酸酯和一端为甲基的双取代环碳酸酯，对短链脂肪族和 芳香族类环碳酸酯的研究较少，所以筛选新的环碳酸酯水解酶，制备光学纯苯乙 二醇具有重要的意义。本专利技术中涉及到另一类手性分子手性扁桃酸及其衍生物同样具备广阔的开-发前景。光学纯扁桃酸主要应用于医药工业，可用于合成环扁桃酯、扁桃酸乌洛 托品、盐酸奥西布宁等医药的手性中间体。制备光学纯扁桃酸及其衍生物的主要方法包括高压结晶法、色谱法、酶法拆 分。酶法拆分包括使用腈水解酶或腈水合酶与酰胺酶的组合进行外消旋扁桃腈的 立体选择性水解；或使用脂肪酶催化扁桃酸酯的水解拆分。到目前为止，使用酶 法催化乙酰扁桃酸水解拆分的报道非常少。本专利技术筛选得到的菌株可以对映选择 性水解乙酰扁桃酸及其衍生物，获取光学纯扁桃酸及其衍生物，,从而拓展了底物 谱、扩大了生物催化剂的应用。
技术实现思路
本专利技术公开了 一株新分离的芽孢杆菌及其用于制备光学活性二醇、扁桃酸以 及邻氯扁桃酸的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。本专利技术的芽孢杆菌(^^7/"s sp. ECU0015)是属于芽孢杆菌属，是专利技术人从土 壤样品中，经过初筛、复筛及分离纯化得到的高选择性环碳酸酯水解酶产生菌， 该菌株己于2009年01月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.2874。上述的菌株是从上海、河北、江苏、山东、山西、湖北等地区的300余份土壤中筛选得到的，筛选的具体步骤如下从不同的环境中采集土壤样品，利用苯乙二醇环碳酸酯为唯一碳源，进行两 轮富集培养，筛选环碳酸酯水解酶产生菌。通过反复筛选，分离得到一株高活力 和高选择性的环碳酸酯水解酶产生菌。本专利技术的菌种具有如下的微生物学特征1、 形态大小杆状或椭圆形，0.7~1.0^im x 3~5^m;2、 适宜生长环境适宜的生长温度为25 35 °C，可以在pH5 9环境中生存；3、 平板培养菌落特性在30'C平板上培养12h可形成小的菌落，36h形成干燥、平展的灰色菌落， 边缘不规则，中间突出。根据"伯杰氏鉴定手册"提供的鉴定方法和上述的微生物学特征，并经16S rDNA鉴定，确认该菌株为芽孢杆菌属(万a"7/iwsp.)，标号为Bflc!7/ws sp. ECU0015。本专利技术的芽孢杆菌株5ac///1^ sp. ECU0015可以用于生产单一对映体的苯乙二醇、扁桃酸或邻氯扁桃酸，生产的方法包括如下的步骤(1) 菌种的准备将芽孢杆菌株B""7/M; sp. ECU0015在灭过菌(121 °C， 20~40 min)的丰富培养 基(例如甘油1%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.8%，琼脂1.5。/。)平板上划线，于25~30 。C静置培养约1-2天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养(培养条件同上)，约 2天后保存于4'C冰箱中备用。(2) 菌株的培养将所说的芽孢杆菌株^^7/w sp. ECU0015采用本领域常规的方法，在发酵培 养基中进行扩增培养24 48 h，温度20~50 °C;再以上述培养液作为种子，基于发酵培养基体积的接种量为1~10%&/力，接 种至50ml的发酵培养基中，在20 50'C下100 180rpm摇床上培养24 48h，离心 得到静息细胞；所说的发酵培养基可采用常规的培养基，其中各组分的含量如下:甘油10~50 g/L，牛肉膏l 20g/L，蛋白胨l~20g/L， KH2P04 l~10g/L， Na2HP04 1 10 g/L，NaC10.1~2g/L， MgSO40.1~2g/L， pH3~8。 (3)底物的生物转化将收获的静息细胞，悬浮于pH为6.0 8.0的磷酸缓冲溶液中，静息细胞的含 量为IO-IOO g (湿重)/L;加入苯乙二醇环碳酸酯或其它底物，最终浓度为5 100 mM，在25 40。C和100 160rpm的恒温摇床上振荡反应1248h，然后从反应液中 提取产物(5)-(-)-苯乙二醇、(及)-扁桃酸或(及)-间氯扁桃酸，产品光学纯度接近或 高于98%。由上述公开的技术方案可见，采用本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株芽孢杆菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＥＣＵ００１５，保藏号为ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２８７４。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许建和，常磊，潘江，徐毅，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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