具有提高镉抗性及促进生物量提升的植物编码基因及蛋白和转基因株系制造技术

本发明专利技术公开了具有提高镉抗性及促进生物量提升的植物编码基因及蛋白和转基因株系。本发明专利技术通过对镉胁迫处理柳枝稷开展RNA

【技术实现步骤摘要】
具有提高镉抗性及促进生物量提升的植物编码基因及蛋白和转基因株系


[0001]本专利技术涉及基因及蛋白，特别涉及具有提高镉抗性及促进生物量提升的植物编码基因及蛋白。

技术介绍

[0002]由于经济发展较快，工业化、城市化进程造成大量“三废”排放以及农业生产中农药、化肥的滥用，土壤重金属镉(Cd)污染程度呈直线上升趋势，远高于其他污染物超标率，高居土壤重金属污染榜首，土壤Cd污染治理迫在眉睫、刻不容缓。
[0003]柳枝稷(Panicum virgatum L.)是起源于北美的多年生高杆C4草本植物，与传统作物相比，柳枝稷的适应性强，抗虫、需肥少，产量高，最高产量可达到74.1t
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hm2。柳枝稷不仅生物量大，而且细胞壁干物质木质素和纤维素的含量极高，是生产生物热能、乙醇和甲烷的模式植物，早在1992年柳枝稷就被美国能源署(DOE)选择确立为模式生物能源作物。作为主要的重金属污染物，镉(Cd)能被作物从土壤环境里吸收，转运到叶和籽粒这样的食用部分，同时这些粮食中的Cd能造成人类患上严重的、长期的疾病。对Cd污染土地种植覆盖植被是有效的治理策略。多年生的生物能源草，一般具有较高生物量、拥有强健发达根系，是Cd污染地域重新种植的合适候选植物，能用来还原地面覆盖植被甚至逐渐恢复生态系统。柳枝稷很适合边际土地上种植，它强大的根系能有效地改善土壤流失，重复种植收获柳枝稷(生物量)，能吸收、减少土壤中Cd含量。经燃烧或细胞发酵之后的灰烬(残渣)被收集(利用)，不会带来环境污染的风险。研究表明，柳枝稷对Cd有一定耐性，但Cd对柳枝稷生长的抑制作用也很明显。是否可从柳枝稷中挖掘Cd胁迫响应基因，对实施柳枝稷分子遗传改良，创新能源草
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Cd修复兼用型柳枝稷种质材料，为治理修复Cd等重金属污染土地、恢复生态功能具有重要意义。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：本专利技术目的是提供具有提高镉抗性及促进生物量提升的植物编码基因，将该基因命名为PvBiP2。
[0005]本专利技术的另一目的是提供具有提高镉抗性及促进生物量提升的植物编码的蛋白和转基因株系。
[0006]技术方案：所述具有提高镉抗性及促进生物量提升的植物编码基因，CDS序列如seq.id.no.1所示。
[0007][0008][0009]所述基因编码的蛋白，序列如seq.id.no.2所示。
[0010][0011][0012]本专利技术通过对镉胁迫处理柳枝稷开展RNA
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seq测序，筛选出上调倍数最高的差异表达基因，基因组注释表明该基因编码热激蛋白70家族(Hsp70)成员——分子伴侣BiP(Binding Protein)蛋白，将该基因命名为PvBiP2。构建其过表达载体转入镉敏感型酵母突变体菌株(ycf1)中，在含镉培养基上转基因酵母的生长状况明显优于对照组。将所述PvBiP2基因在柳枝稷中过表达，发现可以显著提高转基因柳枝稷的镉抗性并促进柳枝稷生物量提高。
[0013]一种由前述基因构建的pCambia1305.2
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PvBiP2转基因株系。
[0014]有益效果：本专利技术与现有技术相比，具有如下优势：
[0015]1、本专利技术提供了一种具有提高镉抗性及促进生物量提升的植物编码基因PvBiP2，该基因目前尚未见相关的报道研究，该基因源自于镉胁迫处理柳枝稷根系RNA
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seq测序结果中的上调差异表达基因；通过构建PvBiP2的酵母表达载体，利用酵母点板实验可验证本专利技术所述基因能提高酵母镉抗性。
[0016]2、本专利技术将PvBiP2基因柳枝稷中过表达，发现该基因可以显著提高转基因柳枝稷镉抗性，镉胁迫处理后，转基因植株的表型、生物量以及生理和光合指标都明显优于WT，并且能够在根系维持较高浓度镉、地上部分较低浓度镉含量。与野生型(WT)柳枝稷比较，正常条件下，转基因植株的株高、茎粗和叶片宽度显著(P＜0.05)高于WT。
[0017]3、本专利技术所述的PvBiP2基因为培育能源草
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镉修复兼用型柳枝稷种质提供基因资源，可应用于镉污染地区的治理中，在研究植物生物修复技术、改善土壤重金属污染状况等方面起着重要作用。
附图说明
[0018]图1为PCR扩增的PvBiP2基因的产物条带；
[0019]图2为PvBiP2基因在镉胁迫下的酵母功能验证；
[0020]YCF1/pGAD426
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GUS为空白对照Cd敏感酵母菌株，YCF1/pGAD426
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PvBiP2为转基因酵母菌株；
[0021]图3为过表达载体pCambia1305.2
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PvBiP2构建与转化农杆菌，a.PvBiP2连接到pEND
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linker克隆载体；b.线性化后,pEND
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PvBiP2经LR反应连入pCambia1305.2双元表达载体；c.农杆菌单菌落(1
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3)菌液PCR鉴定；
[0022]图4为农杆菌介导过表达PvBiP2柳枝稷遗传转化流程，a.胚性愈伤组织b.筛选抗性愈伤组织c.抗性芽分化d.抗性芽生根e.转基因植株f.转基因植株温室培养；
[0023]图5为转PvBiP2基因柳枝稷鉴定与表达量分析，a.PvBiP2基因过表达载体模式；b.PCR扩增hpt II基因(M：maker；EV：pCambia1302
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PvBiP2质粒：WT：野生型柳枝稷；1
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5：5个转基因株系)；c.柳枝稷转基因株系GUS染色结果；d.野生型和转基因柳枝稷PvBiP2基因表达量比较(野生型的表达量设为1，误差线表示平均值
±
SE，n＝3，不同小写字母表示差异显
著水平为P＜0.05)；
[0024]图6PvBiP2
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OE柳枝稷和野生型柳枝稷在无Cd和Cd胁迫下表型和生物量分析PvBiP2
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OE和野生型柳枝稷在无Cd和Cd胁迫处理30d后的茎叶(A)和根系(B)表型分析；不同浓度镉处理下柳枝稷PvBiP2
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OE株系和野生型的茎叶鲜重(C)、茎叶干重(D)、根系鲜重(E)和根系干重(F)分析，误差线表示平均值
±
SE，n＝4，不同小写字母表示差异显著水平为P＜0.05)；
[0025]图7为PvBiP2
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OE柳枝稷和野生型柳枝稷在无Cd和有Cd胁迫处理下生理指标分析，
[0026]PvBiP2
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OE和野生型柳枝稷在无Cd和Cd胁迫处理30d后测量如下生理指标：(A)叶片相对含水量(RWC)；(B)谷胱甘肽(GSH)；(C)相对电导率(EL)；(D)丙二醛(MDA)含量；(E)脯氨酸含量；(F)可溶性蛋白含量，误差线表示平均值
±
SE，n＝4，不同小写字母表示差异显著水平为P＜0.05；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有提高镉抗性及促进生物量提升的植物编码基因，CDS序列如seq.id.no.1所示。2.一种由权利要求1所述基因编码的蛋白，序列如seq....

【专利技术属性】
技术研发人员：宋刚，张敬，徐彬，方志刚，王玉龙，蔡庆生，
申请(专利权)人：江苏农林职业技术学院，
类型：发明
国别省市：