一种鉴定八倍体半夏的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定半夏八倍体的方法，所述方法包括以下步骤：(1)利用流式细胞术初步分析所收集半夏材料的基因组大小范围。即以辣椒为内参，取半夏叶片与辣椒叶片双切样品，完成流式细胞术测定。通过样本与内参峰面积比计算供试半夏样品的基因组大小。(2)根据步骤(1)的结果，选取基因组大小在7.8～8.2Gb范围内的半夏材料，取其处于细胞分裂旺盛时期的根尖，经预处理、固定、解离和压片后，于显微镜观察，以染色体计数的方式确定待测材料的倍性。当总染色体条数为104条时，则确定该半夏植株倍性为八倍体。本发明专利技术采用流式细胞术测定结合根尖染色体计数方法，可以快速筛选并准确鉴定八倍体半夏植株，兼具效率与准确性的优势。兼具效率与准确性的优势。兼具效率与准确性的优势。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定八倍体半夏的方法


[0001]本专利技术属于生物技术研究领域，具体涉及一种高效准确鉴定八倍体半夏的方法。

技术介绍

[0002]半夏(Pinellia ternata)为天南星科(Araceae)中半夏属(Pinellia)的物种。在东亚多个地区均有分布。其药用部位为块茎，具有止吐、止咳和抗抑郁等功效。在《中国药典》的草药方剂中使用频次居22位。不同居群半夏倍性调查发现，半夏为多倍体复合体，其倍性集中在七至十倍体之间(x＝13)，且存在较多非整倍体。可用的高质量参考基因组序列是阐明物种起源、进化历史及揭示其表型多样性遗传基础的关键，八倍体植株是合适的获得高质量半夏参考基因组序列的材料。
[0003]申请人于前期调查发现，分布于我国的半夏植株大多为七至十倍体的多倍体复合体，快速准确地确定八倍体半夏植株，可为半夏的功能基因组研究提供明确的基因资源，有助于在染色体水平获得半夏全基因组精细图谱，为其进化分析、发育过程解析及功能基因等的研究奠定基础。
[0004]目前流式细胞术虽已较多应用于植物倍性的检测，并且表现出快速准确的优势。但其在非整倍体植物中的应用鲜有报道。传统染色体根尖计数方法是公认的具有极高准确性的确定植物倍性的方法，但在大批量的多种倍性材料中筛选目标倍性样品时并不高效。半夏为多倍体复合体，其居群内同时存在整倍体及非整倍体植株，无法单独采用流式细胞仪准确筛选八倍体植株。而本专利技术采用流式细胞术结合根尖染色体计数的方法，可以实现从大量半夏植株中快速减少测试样品的筛选数目，进而达到准确高效鉴定得到八倍体半夏的目标。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种准确、高效获取八倍体半夏材料的方法。该方法将流式细胞术与传统根尖染色体计数技术相结合的方法，具有兼具效率与准确性的优势。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]一种高效准确筛选半夏八倍体的方法，包括流式细胞术初步分析及根尖染色体计数两个技术手段：首先使用流式细胞术初步分析所收集半夏材料的基因组大小范围，初步明确所收集半夏材料的基因组大小范围后，选取基因组大小在7.8～8.2Gb范围内的不同半夏材料。取其长势良好的根尖进行处理，精确统计其根尖细胞染色体数目，计数得到包含104条染色体的材料即为八倍体半夏植株。
[0008]其中，使用流式细胞术初步分析所收集半夏材料的基因组大小范围，包括以下步骤：
[0009](1)取样：取待测半夏样品叶片及内参辣椒鲜样中较幼嫩叶片；
[0010](2)混悬液制备：将叶片与细胞核提取液均置于塑料培养皿中，使用刀片将其快速切碎，使细胞解离，得到待测样品与细胞核提取液的混悬液；
[0011](3)过滤：采用移液枪将混悬液吸取，使用滤网过滤混悬液至流式管内；
[0012](4)暗处理：于装有混悬液的流式管内，加入RNase试剂和PI染液，室温暗处理；
[0013](5)半夏材料流式细胞术结果获得：将暗处理后的混悬液上机测序，每个试样3次重复，平均结果用于计算样本基因组大小；计算公式为：半夏样本基因组大小(Gb)＝(半夏样本峰面积/内参峰面积)
×
3.34Gb。
[0014]进一步地，步骤(1)中，所述样品以半夏样本与内参辣椒叶片比例为7:1进行取样，半夏和辣椒叶片总面积约0.5cm2。
[0015]优选地，步骤(2)中，所述细胞核提取液为PVPk12
‑
mGB2，其pH为7.0，加入量为350μL。
[0016]进一步地，步骤(3)中，所述滤网为300目滤网。
[0017]进一步地，步骤(4)中，所述混悬液终浓度为50g/mL。
[0018]优选地，步骤(4)中，所述室温黑暗处理时长为15min。
[0019]优选地，步骤(5)中，所述上机测试中波长选用317nm。
[0020]其中，根尖染色体计数包括以下步骤：
[0021](1)预处理：取候选半夏材料的根尖，洗净后置于EP管中，再向其中加入预处理液，置于室温下黑暗处理；
[0022](2)固定：将步骤(1)中黑暗处理后的样品漂洗3次，随后用固定液在室温固定；
[0023](3)解离：将步骤(2)中固定液处理后的样品漂洗3次，随后使用盐酸溶液将样品解离；
[0024](4)染色压片：将步骤(3)中固定液处理后的样品漂洗3次，随后进行根尖染色，压片；
[0025](5)显微观察：使用显微镜观察并拍照记录；
[0026]进一步地，步骤(1)中，所述根尖长度约为0.5cm，所述预处理溶液为0.002mol/L的8
‑
羟基喹啉溶液，所述黑暗处理时长为6h。
[0027]进一步地，步骤(2)中，所述固定液为卡诺固定液，以无水乙醇与冰醋酸比例3:1进行配制。需现配现用，所述室温固定时长为3h。
[0028]进一步地，步骤(3)中，所述盐酸溶液为1mol/L HCl溶液；所述水浴解离条件为，于60℃水浴解离约10min。
[0029]进一步地，步骤(4)中，所述染色过程为，将根尖放置于载玻片上，吸干表面水分，用卡宝品红染液染色15min及以上时长。
[0030]进一步地，步骤(5)中，所述显微镜观察，采用Nikon 80i显微镜，在50x物镜
×
10x目镜下拍照记录。
[0031]本专利技术的有益效果在于：
[0032]本专利技术将流式细胞术与传统根尖染色体计数技术相结合的方法，首先采用流式细胞术测定大批量半夏材料，使用辣椒作为内参，有助于快速明确收集材料的基因组大小范围，其次，选取基因组大小在7.8～8.2Gb范围内的不同半夏材料，选其长势良好的根尖完成根尖染色体计数，计数得到包含104条染色体的材料即为八倍体半夏植株(n＝8x＝104)，兼具效率与准确性的优势，可为半夏的功能基因组研究提供明确的基因资源，有助于在染色体水平获得半夏全基因组精细图谱，为其进化分析、发育过程解析及功能基因等的研究奠
定基础。
附图说明
[0033]图1是不同来源30株半夏植株的流式细胞术测定结果柱形图；
[0034]图2是两株供试半夏的流式细胞术测定结果图及根尖染色体计数结果；
[0035]其中，图2A图是利用流式细胞术测得基因组大小为7.95Gb半夏材料的流式细胞结果图；
[0036]图2B图是利用流式细胞术测得基因组大小为8.18Gb半夏材料的流式细胞结果图；
[0037]图2C图是基因组大小为7.95Gb半夏材料的根尖染色体计数结果，其根尖染色体数目为103；图2D图是基因组大小为8.18Gb半夏材料的根尖染色体计数结果，其根尖染色体数目为104。
具体实施方式
[0038]以下结合附图对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术为技术前提下进行实施，给出了详细的实施过程和方法。但本专利技术的保护范围不限于该实施例。本专利技术的保护范围本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定半夏八倍体的方法，其特征在于，所述方法为首先通过流式细胞术初步分析所收集半夏材料的基因组大小范围，结合鉴定结果，选取基因组大小在7.8～8.2Gb范围内的不同半夏材料，取其根尖进行染色体数目统计，染色体总条数为104条的材料即为八倍体半夏植株。2.根据权利要求1所述的筛选半夏八倍体的方法，其特征在于，所述流式细胞术初步分析采用辣椒作为内参，使用细胞核提取液、PI染液与RNase试剂完成供试半夏材料的流式细胞术测定，初步分析所收集半夏材料的基因组大小范围；具体包括以下步骤：(1)配制细胞核提取液；(2)取半夏及辣椒鲜样中幼嫩叶片共0.5cm2大小，半夏与辣椒的叶片面积比例为7:1，加入步骤(1)配制的细胞核提取液，用刀片快速切碎、解离，得到样品与提取液的混悬液；(3)采用移液枪将混悬液吸取，用300目滤网过滤混悬液到流式管内；(4)加入RNase试剂和PI染液，使混悬液终浓度达到50g/mL，室温黑暗处理15min，每个试样3次重复。3.根据权利要求1所述的筛选半夏八倍体的方法，其特征在于，根尖染色体计数的具体操作步骤为：取长度为0.5cm、生长健壮处于细胞分裂旺盛时期待测材料的根尖，依次进行预处理、固定、解离、染色及显微观察，选取染色体总条数为104的材料。4.根据权利要求2所述的筛选半夏八倍体的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：李西文，冯雪，裴艺菲，
申请(专利权)人：中国中医科学院中药研究所，
类型：发明
国别省市：